ICS 65.020 CCS B 05 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 3333—2022 杂交大豆 RN 型“三系”恢保快速鉴定规程 Cord of practice for restorer line or maintainer line of hybrid soybean RN three-line 2022 - 01 - 28 发布 吉林省市场监督管理厅 2022 - 02 - 28 实施 发 布 DB22/T 3333—2022 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：吉林省农业科学院。 本文件主要起草人：张井勇、张春宝、赵丽梅、彭宝、闫昊、张伟、林春晶、王鹏年、丁孝羊、李 慧、孙寰、刘大壮、姚福山。 I DB22/T 3333—2022 杂交大豆 RN 型"三系"恢保快速鉴定规程 1 范围 本文件确立了杂交大豆RN型“三系”恢保快速鉴定的程序，规定了测交材料准备、测交、测交结果 的鉴定等阶段的操作指示，描述了记录与档案等追溯方法。 本文件适用于杂交大豆 RN 型“三系”恢保快速鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 1299-2007 农作物品种区域试验技术规程 大豆 DB22/T 2209-2014 杂交大豆种子 DB22/T 3177-2020 杂交大豆质核互作雄性不育系鉴定规程 3 术语与定义 DB22/T 2209-2014 和 DB22/T 3177-2020 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 雄性不育系 male sterility line 雄蕊发育退化或败育，不能产生有功能的花粉，但它的雌蕊发育正常，能接受正常花粉而受精结实， 并能将雄性不育性遗传给后代的品系。 [ 来源：DB22/T 2209-2014，3.1 ] 3.2 质核互作雄性不育系 cytoplasmic male sterility line 由细胞质基因与核基因互作控制的雄性不育系类型，是广泛存在于高等植物中的一种自然现象。在 农作物的杂种优势利用上具有重要价值。按照雄性不育花粉的败育过程，可分为孢子体不育和配子体不 育两种类型。 3.3 RN型“三系” RN three-line 不育细胞质来源为大豆地方品种“汝南天鹅蛋”的雄性不育系、对应保持系和恢复系，简称RN型 “三系”。 3.4 测交 testcross 利用育成的稳定不育系为母本，待测种质为父本进行杂交，测验大豆种质的恢复或保持特性。 3.5 母本 the female parent 1 DB22/T 3333—2022 参与杂交的亲本之一，也指不同植株的花进行异花传粉时，接收花粉的植株，本标准中，母本指测 交用RN型大豆不育系。 3.6 父本 the male parent 参与杂交的亲本之一，在植物中是雄性个体或产生雄性生殖细胞的个体，本标准中为提供花粉的个 体，本标准中，父本指待测大豆种质。 3.7 花粉败育率 pollen abortion rate 不育花粉数占总花粉数的百分比。 [ 来源：DB22/T 3177-2020，2.5 ] 3.8 恢复系 restorer line 大豆品种或品系，它的特殊功能是用它的花粉授给不育系，所产生的杂交种育性恢复正常，能自交 结实，如果该杂交种有优势，可用于生产。 [ 来源：DB22/T 2209-2014，3.3，有修改 ] 3.9 保持系 maintainer line 保持系可以保持不育系的不育特性，和不育系杂交，当代可以结实，但是子代仍然是不育系，可以 让不育系得到繁殖，保有不育系材料。 [ 来源：DB22/T 2209-2014，3.2 ] 4 杂交大豆 RN 型“三系”恢保快速鉴定流程 杂交大豆 RN 型“三系”恢保快速鉴定规程包括 4 个阶段，其中测交结果鉴定分 3 种情况（7.2.2～ 7.2.4），流程图如图 1 所示。 图1 2 杂交大豆 RN 型“三系”恢保快速鉴定流程图 DB22/T 3333—2022 5 “三系”测交材料准备 5.1 新种质资源引进 根据不同育种目标，有针对性的引进、收集及创制优良品种或品系。 5.2 新种质性状登记 5.2.1 整理及编号 对新种质的种子进行去杂去劣，登记种子的特征特性，包括种皮色、粒形、种脐色，并对其进行统 一编号。 5.2.2 种植及田间性状调查 5.2.2.1 在田间播种新种质，株距 10 cm，行距 60 cm ～ 65 cm。 5.2.2.2 出苗期至成熟期观察下胚轴颜色、叶形、花色、抗病虫性、抗逆性、成熟期、株型、荚形、 结荚习性、茸毛色、株高整齐度，按照 NY/T 1299-2007 规定执行。 5.2.3 考种 成熟后，在行中间位置选连续不缺苗 5 株进行考种，考种项目包括株高、节数、底荚高度、分枝 数、单株有效荚数、荚形、荚皮色、单株粒数、单株粒重、百粒重、粒形、粒色、种脐色、籽粒光泽等。 6 测交 6.1 测交组合配制 6.1.1 测交母本的选择 6.1.1.1 母本 1 RN 型易被恢复不育系，以 JLSCMS82A 为代表，这类不育系，可被所有恢复系恢复，且多数F1花粉 败育率在 0%～10%。 6.1.1.2 母本 2 RN 型难被恢复不育系，以JLSCMS89A为代表，这类不育系，只能被极少数恢复系恢复，绝大多数 F1 花粉败育率为 61.0% 以上。 6.1.2 测交用父本 任一待测种质为父本。 6.2 测交组合田间种植 6.2.1 人工杂交授粉方式的田间播种 采用母本、父本行相邻播种，便于杂交授粉。 6.2.2 昆虫传粉方式的田间播种 3 DB22/T 3333—2022 按小区播种，小区大小为 1.2 m×1.2 m，在小区内按行播种父本 2 穴、母本 1 及母本 2 各 2 穴， 穴距 30 cm～40 cm，穴保苗 2 株，在开花期罩上大小为 1.2 m×1.2 m×1.5 m 微型网室。 6.3 杂交 6.3.1 杂交授粉 6.3.1.1 人工杂交授粉 取待测种质当天新鲜花粉，分别对母本 1、母本 2 进行不去雄杂交授粉，并标记授粉花蕾。 6.3.1.2 昆虫传粉 开花期，在播种母本 1、母本 2、任一待测种质（父本）的微型网室内，投放 3 头～ 5 头苜蓿切 叶蜂或 50 头～ 100 头蜜蜂传粉。 6.3.2 种子收获 分别收获母本不育系植株上的杂交种子和父本植株上的种子。 7 测交结果的鉴定 7.1 测交 F1 杂种的种植 在田间播种测交 F1 种子，行长 2.0 m，单株株距 10 cm，行距 60 cm～65 cm，保证至少获得 5 株 以上 F1 植株。 7.2 7.2.1 测交 F1 杂种花粉败育率鉴定 花粉取样镜检 在 F1 植株盛花期，从 5 个单株主茎上、中、下各个部位各取 2 个未开放花蕾，鉴定方法采用 1% I2-KI 染色法鉴定花粉败育率，可被染色花粉视为正常可育花粉，未被染色花粉视为败育花粉，按照附 录 A 1.3 公式（A.1）计算花粉败育率，统计花粉败育率，用平均值表示。 7.2.2 新恢复系的鉴定 7.2.2.1 当 F1 植株花粉败育率为 0%～70.0% 时，可确定待测种质为恢复系； 7.2.2.2 依据母本 1 和母本 2 测交 F1 植株花粉败育率的共同表现，按照附录 B 中表 B.1 确定其 恢复力： a) 由母本 1 测交获得 F1 植株花粉败育率为 0%～10.0%，同时由母本 2 测交获得 F1 植株花粉败 育率 0%～50.0% 时，确定该待测种质为强恢复系； b) 由母本 1 测交获得 F1 植株花粉败育率为 10.1%～30.0%，同时由母本 2 测交获得 F1 植株花 粉败育率为 50.1%～90.0% 时，确定该待测种质为一般恢复系； c) 由母本 1 测交获得 F1 植株花粉败育率为 10.1%～50.0%，同时由母本 2 测交获得 F1 植株花 粉败育率为 90.1%～99.0% 时，确定该待测种质为弱恢复系。 7.2.3 新保持系的鉴定 当由母本 1 和母本 2 测交获得 F1 植株花粉败育率均为 95.0% 以上时，可确定被检测种质为新保 持系。 4 DB22/T 3333—2022 7.2.4 非恢复系、非保持系的鉴定 由母本 1 测交获得 F1 植株花粉败育率为 70.1%～90.0%，同时由母本 2 测交获得 F1 植株花粉败 育率为 70.1%～100% 时，确定该待测种质为即非恢复系、也非保持系。 8 记录与档案 应对鉴定的过程和关键步骤进行及时详尽记录，并按时归档。档案保存期限不低于 2 年。 5 DB22/T 3333—2022 AA 附 录 A （规范性） 杂交大豆 RN 型“三系”恢保关系鉴定 A.1 花粉育性鉴定 A.1.1 花粉镜检 F1植株始花期每株取主茎上、中、下各个部位 3 个未开放花蕾各 2 朵，用 70% 的酒精溶液固定， 然后取出花药置于 0.56% 的I2-KI染色液的载玻片上，捣碎花药挤出花粉，使花粉均匀分布，在 160 倍 显微镜下进行全视野观察后，再选3个有代表性视野计数各类花粉的数量，凡染色花粉较多的植株复检 一次。为防止人为误差，要求同一品种材料由同一个人完成花粉镜检，并保持操作的一致性。 A.1.2 花粉类型 根据在显微镜下观察花粉可被染色花粉视为正常可育花粉，未被染色花粉视为败育花粉。 A.1.3 花粉败育率 经 I2-KI 染色液染色后，大豆花粉未被染色花粉数占总花粉数的百分比。 花粉败育率计算按公式（A.1） S  NT  N  100 ................................ (A.1) NT 式中： S——花粉败育率，单位为百分比（%）； NT——观测花粉粒总数，单位为粒； N——正常被染色花粉粒总数，单位为粒。 计算结果精确到小数点后一位。 6 DB22/T 3333—2022 BB 附 录 B （规范性） 杂交大豆 RN 型“三系”恢保关系鉴定 表 B.1 给出了杂交大豆RN型“三系”恢、保关系分类。 表B.