ICS 13.100 C 50 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3762.16—2021 新型冠状病毒检测技术规范 第 16 部分：核酸数字 PCR 法 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 16: Novel coronavirus nucleic acid digital PCR test procedure 2021-12- 09 发布 江苏省市场监督管理局 2022 - 01 - 09 实施 发 布 DB32/T 3762.16—2021 目 前 次 言 ...................................................................... II 1 范围 ........................................................................ 1 2 规范性引用文件 .............................................................. 1 3 术语和定义 .................................................................. 1 4 缩略语 ...................................................................... 1 5 原理 ........................................................................ 1 6 基本要求 .................................................................... 2 7 试剂与材料 .................................................................. 2 8 仪器与设备 .................................................................. 2 9 操作步骤 .................................................................... 2 I DB32/T 3762.16—2021 前 言 DB32/T 3762《新型冠状病毒检测技术规范》目前分为以下部分： ——第1部分：生物样本采集、运输和保存； ——第2部分：病毒分离与鉴定； ——第3部分：核酸荧光PCR检测程序； ——第4部分：重组酶介导等温扩增程序； ——第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； ——第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； ——第7部分：空气样本检测与评估； ——第8部分：物体表面检测与评估； ——第9部分：医务人员职业暴露检测与评估； ——第10部分：微量血清中和试验； ——第11部分：全基因组高通量测序； ——第12部分：药物体外抗病毒效果测定； ——第13部分：叠氮溴化丙锭-荧光PCR检测程序； ——第14部分：N亚基因组荧光PCR检测程序； ——第15部分：血清/血浆IgM和IgG抗体磁微粒化学发光法检测程序； ——第16部分：核酸数字PCR法； ——第17部分：核酸检测用假病毒阳性质控品； ——第18部分：规模化核酸检测程序。 本文件为 DB 32/T 3762 的第16部分。 本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由江苏省卫生健康委员会提出。 本文件由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本文件主要起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京市计量监督检测院、苏州市疾病预防控制中 心、泰州市疾病预防控制中心、苏州锐讯生物科技有限公司、北京新羿生物科技有限公司。 本文件主要起草人：洪捷、林婧、蒋云宇、周恺、周连、王慎骄、朱立国、王尚君、范宇宸、朱宝 立、王雅琦、李家琛、董嘉、祝令香、王楠。 II DB32/T 3762.16—2021 新型冠状病毒检测技术规范 第 16 部分：核酸数字 PCR 法 1 范围 本文件规定了新型冠状病毒核酸数字 PCR 检测方法。 本文件适用于新冠病例、一般人群和重点人群的生物样本，包括口咽拭子、鼻咽拭子、血标本、肛 拭子等，以及其他需要检测的样本的核算数字 PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 DB 32/T 3762.3 新型冠状病毒检测技术规范 第 3 部分：核酸荧光 PCR 检测程序 3 术语和定义 本文件没有界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 数字 PCR：数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction） ORF1a/b：开放阅读框 1a/b（open reading frame） dNTPs：脱氧核糖核酸三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） 人 RNase P 基因：人核糖体核酸酶基因（Ribonuclease P） 5 原理 一种对核酸分子进行绝对定量的实验技术，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应 单元，每个单元至少包含一个拷贝的目标分子。在每个反应单元中分别对目标分子进行 PCR 扩增，扩 增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，进而计算出原始样本中目标分子浓度。 目前数字 PCR 技术包括芯片式和微滴式两种，芯片式通过微流控芯片实现对原始反应体系的分 割，该方法具有稳定性好，均一性好的优点，但检测成本相对较高。微滴式通过产生微小油包水体系实 现体系的分割，该方法有反应速度快，检测成本低的优点。为了实现对新型冠状病毒核酸数字PCR的定 量检测，本标准通过数字PCR的扩增反应直接得出新冠病毒 ORF1a/b 基因和 N 基因的拷贝数。 6 基本要求 6.1 实验室资质及级别 1 DB32/T 3762.16—2021 检测工作应在BSL-2级实验室进行。生物安全要求遵照 GB 19489 和 DB 32/T 3762.3 规定执行。 6.2 操作人员资质及防护 实验过程中的个人防护遵照 GB 19489 第8条和 DB 32/T 3762.3 规定执行。 7 试剂与材料 7.1 新冠病毒核酸提取试剂盒：应当选择国家药品监督管理部门批准的试剂，建议选择磁珠法、膜吸 附法等进行核酸提取。 7.2 新冠病毒数字 PCR 预混液：含有镁离子，dNTPs、RNA 酶抑制剂、逆转录酶和 DNA 聚合酶等组 分的数字 PCR 预混液，推荐根据不同的数字 PCR 方法和仪器选择不同的试剂。 7.3 引物序列和探针：检测新冠病毒 ORF1a/b 基因和 N 基因的引物和探针序列见表 1。 表1 新冠病毒 ORF1a/b 基因和 N 基因的引物和探针序列 标靶 名称 新 型 冠 状 病 毒 上游引物 序列 CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 下游引物 ACGATTGTGCATCAGCTGA 探针 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3' 新型冠状病毒N基 上游引物 GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT 因 下游引物 CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG 探针 5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3' ORF1ab基因 8 仪器与设备 8.1 生物安全柜。 8.2 生物安全型离心机。 8.3 涡旋振荡器。 8.4 恒温金属浴。 8.5 核酸提取仪。 8.6 数字 PCR 仪。 9 操作步骤 9.1 样本前处理 2 DB32/T 3762.16—2021 按照DB 32/T 3762.3 中的 7.1 规定执行。 9.2 核酸提取 按照DB 32/T 3762.3 中的 7.2 规定执行。 9.3 数字 PCR 扩增方法 9.3.1 数字 PCR 反应体系 数字PCR仪反应体系的总体积根据不同厂家、不同型号的仪器设备需进行相应的调整，并保持各引 物探针组分终浓度不变。 9.3.2 数字 PCR 反应程序 数字PCR反应程序如表2，不同方法和不同仪器设备及试剂反应程序可能存在差异，需进行调整。 表2 数字 PCR 反应程序 步骤 温度 时间 循环数 1 50 ℃ 60 min 1 cycle 2 95 ℃ 10 min 1 cycle 95 ℃ 30 s 55 ℃ 1 min 4 98 ℃ 10 min 1 cycle 5 4 ℃ 5 min 1 cycle 3 40 cycles 9.3.3 对照数字 PCR 反应的设定 试验中应设置阳性对照和阴性对照。用含 2019-nCoV ORF1ab 基因特异片段的病毒样颗粒、含 2019-nCoV N基因特异片段的病毒样颗粒和含人 RNase P 基因特异片段的质粒作为阳性对照。用无核 酶水作为阴性对照。 9.4 质量控制与结果分析 9.4.1 质量控制 以下要求其中一条不符合，应重新进行试验，重新进行试验应从核酸提取开始： a) 样本人 RNase P 基因有荧光信号检出； b) 阴性对照无荧光信号； c) 阳性对照两个靶标（ORF1ab 、N）荧光信号均超过设定阈值。 9.4.2 阳性判定 实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个： 3 DB32/T 3762.16—2021 a) b) 同一份样本中新型冠状病毒 2 个靶标（ORF1ab 、 N）数字 PCR 检测结果均 ＞100 copies/mL。 如果出现单个靶标 ＞100 copies/mL 的检测结果，则需要重新采样，重新检测。如果单靶标仍 ＞100 copies/mL，判定为阳性； 同一病例的两种不同类型样本数字 PCR 同时出现单靶标 ＞100 copies/mL，或同种类型样本两 次采样检测中均出现单个靶标 ＞ 100copies/mL 的检测结果，可判定为阳性。 9.4.3 阴性判定 在质量控制符合要求的情况下，如果样本两个