ICS 11.020 C 62 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3762.13—2021 新型冠状病毒检测技术规范 第 13 部分：叠氮溴化丙锭-荧光 PCR 检测程序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 13: PMA-qRT-PCR test procedure 2021 - 12 - 09 发布 江苏省市场监督管理局 2022 - 01 - 09 实施 发 布 DB32/T 3762.13—2021 目 前 次 言 ............................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 环境与设施 ........................................................................ 1 5 设备与耗材 ........................................................................ 1 6 试剂与材料 ........................................................................ 1 7 试验技术要点 ...................................................................... 2 8 样本前处理 ........................................................................ 2 9 样本 PMA 预处理与核酸提取 ......................................................... 2 10 扩增体系配制与扩增 ................................................................. 2 11 阈值设定 ........................................................................... 3 12 样本前处理 ......................................................................... 3 13 结果判断 ........................................................................... 3 I DB32/T 3762.13—2021 前 言 DB32/T 3762《新型冠状病毒检测技术规范》目前分为以下部分： ——第1部分：生物样本采集、运输和保存； ——第2部分：病毒分离与鉴定； ——第3部分：核酸荧光PCR检测程序； ——第4部分：重组酶介导等温扩增程序； ——第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； ——第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； ——第7部分：空气样本检测与评估； ——第8部分：物体表面检测与评估； ——第9部分：医务人员职业暴露检测与评估； ——第10部分：微量血清中和试验； ——第11部分：全基因组高通量测序； ——第12部分：药物体外抗病毒效果测定； ——第13部分：叠氮溴化丙锭-荧光PCR检测程序； ——第14部分：N亚基因组荧光PCR检测程序； ——第15部分：血清/血浆IgM和IgG抗体磁微粒化学发光法检测程序； ——第16部分：核酸数字PCR法； ——第17部分：核酸检测用假病毒阳性质控品； ——第18部分：规模化核酸检测程序。 本文件为DB32/T 3762 的第13部分。 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由江苏省卫生健康委员会提出。 本文件由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本文件主要起草单位：江苏省疾病预防控制中心、扬州市疾病预防控制中心、南京市疾病预防控制 中心、宿迁市疾病预防控制中心。 本文件主要起草人：葛以跃、崔仑标、刘丹丹、朱宝立、迟莹、吴涛、朱小娟、吴斌、赵康辰、乔 乔、徐勤、杜雪飞、戚晓飞。 II DB32/T 3762.13—2021 新型冠状病毒检测技术规范 第 13 部分：叠氮溴化丙锭-荧光 PCR 检测程序 1 范围 本文件规定了新型冠状病毒叠氮溴化丙锭-荧光PCR（PMA-qRT-PCR）检测环境与设施、设备与耗 材、试剂与材料、样本处理与核酸提取、扩增体系配制与扩增和结果判断。 本文件适用于新型冠状病毒 PMA-qRT-PCR 检测，为判断样本中的新型冠状病毒是否具有感染性提 供辅助手段。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本 文件。 DB32/T 3762.3 新型冠状病毒检测技术规范 第3部分：核酸荧光PCR检测程序 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 医疗机构临床基因扩增管理办法 原中华人民共和国卫生部办公厅 医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 原中华人民共和国卫生部检验中心 3 术语和定义 3.1 叠氮溴化丙锭 propidium monoazide；PMA 一种具有高亲和力的光敏反应DNA结合染料，光解后，染料上的光敏叠氮基转变为高反应性的氮 烯自由基，极容易与结合部位核酸的碳氢化合物形成牢固RNA或DNA修饰，修饰后的核酸不能用作PCR 反应模板被扩增。由于PMA不能透过活细胞膜，因此将PMA与PCR联合使用可用于区分死活细胞、细 菌和病毒等。 4 环境与设施 同DB32/T3762.3第4章。 5 设备与耗材 BLU-V曝光系统或卤素灯（650 W），余同DB32/T3762.3第5章。 6 试剂与材料 6.1 试剂 1 DB32/T 3762.13—2021 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.1.5 病毒核酸提取试剂盒。 qRT-PCR扩增试剂盒。 二甲基亚砜（DMSO）。 磷酸盐缓冲液（PBS，PH=7.4）。 叠氮溴化丙锭（PMA）。 6.2 材料 6.2.1 新型冠状病毒核酸检测质控品。 6.2.2 消毒剂：75 %乙醇、有效氯5 500 mg/L的消毒液（需每天新鲜配制）。 7 试验技术要点 用于新型冠状病毒核酸PMA-qRT-PCR检测的样本应采用非灭活型病毒采样管进行采集。 8 样本前处理 8.1 在 BSL-2 实验室生物安全柜内打开样本第二层包装，取出待检样本，核对送检单，若管壁外有不 明液体，应用消毒剂擦拭。 8.2 将样本混匀后分装于 2 mL 带螺旋盖内有垫圈冻存管。在冻存管上标记，注明姓名、样本类型、 日期等。吸取部分样本进行样本 PMA 预处理与核酸提取。所有冻存管旋紧管盖后需用封口膜密封。 9 样本 PMA 预处理与核酸提取 9.1 样本 PMA 预处理 9.1.1 以 20 %二甲基亚砜（DMSO）将 PMA 配置成 2 mM 浓度。 9.1.2 将 PMA 加入到病毒样品中使其达到 200 μM 终浓度，同时取等量 PBS 加入到病毒样本中作为 样品对照组，并做好标记。以同样的方法对新型冠状病毒核酸检测质控品（稀释到 500 拷贝/mL）进行 处理。 9.1.3 将所有样品管混合均匀，室温孵育 10 min。 9.1.4 孵育完成后使用 BLU-V 曝光系统或卤素灯（650 W，样品置于冰上，距离灯源 20 cm）曝光 15 min。 注：以上步骤均在避光条件下进行。 9.2 核酸提取 同 DB32/T3762.3 的7.2条。 10 扩增体系配制与扩增 10.1 将 qRT-PCR 扩增引物和探针（Forward：5′-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3′；Reverse： 5′-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3′；Probe：5′-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG -BHQ1-3′）配置为 10 µM 浓度。 2 DB32/T 3762.13—2021 10.2 采用 qRT-PCR 扩增试剂盒，根据试剂盒说明书配置 qRT-PCR 扩增体系，反应体系中每一条引物 的终浓度为 0.2 µM，每个样品及新型冠状病毒核酸检测质控品均做 3 个重复，同时设立阴性对照。 10.3 在生物安全柜内加核酸模板，然后根据试剂盒说明书设定反应条件进行 qRT-PCR 扩增，共扩增 40 个循环。 10.4 在实验记录本记录加样位置和样本编号。 10.5 未用完核酸样本转入病毒样本专用专人保管冰箱。 11 阈值设定 阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。 12 质控标准 阴性对照结果为阴性。新型冠状病毒核酸检测质控品 PBS处理组出现典型 S 型扩增曲线，Ct值小 于40，且质控品PBS处理组Ct值和PMA预处理组Ct值之间存在统计学差异（阴性结果Ct值记为40）；若 以上对照不成立，此次实验视为无效。 13 结果判断 记录各组样品Ct值，阴性结果Ct值记为40。如果样品PMA预处理组Ct值和PBS处理对照组Ct值之间 无统计学差异，则提示样品中的病毒具有感染性的可能性较大；如果PMA预处理组Ct值和PBS处理对照 组Ct值之间存在统计学差异，则提示样品中的病毒无感染性或者感染性较低。具体判定需结合样品实际 情况进行综合分析。 ________________________________ 3