ICS 65.020.20 CCS B 16 黑 DB23 龙 江 省 地 方 标 准 DB 23/T 2989—2021 玉米线虫矮化病病原长岭发垫刃线虫鉴定 技术规程 2021 - 09 - 08 发布 2021 黑龙江省市场监督管理局 - 10 发布 - 07 实施 DB23/T 2989—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由黑龙江省农业农村厅提出。 本文件起草单位：中国科学院东北地理与农业生态研究所、先正达（中国）投资有限公司。 本文件主要起草人：潘凤娟、李峰、胡岩峰、刘聃、陆欣春、严君、邹文秀。 I DB23/T 2989—2021 玉米线虫矮化病病原长岭发垫刃线虫鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了玉米长岭发垫刃线虫（Trichotylenchus changlingensis）鉴定的取样时期、 取样方法、仪器使用、线虫分离、线虫鉴定和管理档案。 本文件适用于玉米田的玉米线虫性矮化病病原玉米长岭发垫刃线虫（T. changlingensis） 的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期 的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 29577—2013 腐烂茎线虫检疫鉴定方法 SN/T 1141 鳞球茎茎线虫检疫鉴定方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 长岭发垫刃线虫（T. changlingensis） 属于线虫门（Nematoda）、侧尾腺纲（Secernentea）、垫刃目（Tylenchida）、锥科 （Dolichodoridae）、发垫刃属（Trichotylenchus）。 3.2 玉米线虫矮化病 由线虫侵染玉米根部引起的一种玉米苗期病害。玉米4～5叶期症状明显，沿着叶脉方向 出现黄色或白色失绿条纹，茎基部组织纵向或横向开裂、呈“虫道”状，大部分植株茎节缩短 膨大，矮缩或丛生，不结果穗或果穗发育不良。 4 取样时期 在玉米 4～5 叶期，玉米出现矮化症状时取样。 5 取样方法 采用对角线五点取样法，用土壤取样器采集疑似发病植株根围离土表5 cm～15 cm的土 壤约500 g，放入塑料袋中，检测前土样保存在4 ℃～8 ℃条件，最长14 d。取样应在土壤湿 润时进行，避免在土壤过干或浸水时取样。取样调查参见附录A。 6 仪器用具 6.1 仪器 1 DB23/T 2989—2021 正置显微镜、体式显微镜、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速离心机、制冰机、纯 水仪、-80℃冰箱、移液枪和水浴锅。 6.2 用具 500目土样筛、挑针和玻片。 7 线虫分离 线虫分离应按照SN/T1141中的规定执行。 8 线虫鉴定 8.1 形态学鉴定 8.1.1 标本制作 按照SN/T1141中的附录C的要求执行。 8.1.2 线虫形态观察 在显微镜下观察，雌虫虫体较长，呈圆筒状，固定后呈C状；唇区高，缢缩明显；口针 细长，口针基部球略向后倾斜，侧区3 条侧线，尾亚圆柱形，末端光滑无环纹。雄虫虫体略 小于雌虫，交合刺发达，略弯曲，引带发达，交合伞起始于交合刺基部前，包至尾尖。对线 虫标本的形态观察，应严格按照GB/T29577规定执行。参见附录B。 8.2 分子生物学鉴定 依据形态学鉴定结果，再采用分子生物学技术进行鉴定。 8.2.1 线虫 DNA 提取 将线虫置于灭菌去离子水中清洗，挑取单条线虫，切成2段放入10 μL裂解缓冲液[1×PCR Buffer（Mg2+）和6 μg蛋白酶K]中，液氮冷冻2 min，反复冻融2～3 次，60 ℃水浴30 min， 95 ℃ 10 min，12000 r/min离心10 min，取上清DNA提取液，-20℃保存备用。 8.2.2 线虫 28S rDNA 测序 采 用 线 虫 通 用 引 物 D2A （ 5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3' ） 和 D3B （ D3B （5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3'）扩增线虫的28S rDNA序列，扩增产物约900 bp。PCR 反应体系：44 μL PCR Mix，上游引物和下游引物各2 μL，DNA模板约10 ng。反应条件95 ℃ 4 min；一个循环包括94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40个循环，最后72 ℃ 10 min。 PCR扩增产物经回收克隆后送生物公司测序。测序结果与NCBI上已知的结果进行BLAST比 对，与长岭发垫刃线虫（T. changlingensis）序列相似度应在99%以上。参见附录C。 9 管理档案 内容包括土样取样时间和方法、土壤线虫分离方法、长岭发垫刃线虫（T. changlingensis） 形态学鉴定和分子生物学鉴定。档案保存3年以上。 2 DB23/T 2989—2021 附 录 A （资料性） 玉米线虫矮化病病原田间取样调查表 A.1 玉米线虫矮化病病原田间取样调查表参见表A.1。 表A.1 玉米线虫矮化病病原田间取样调查表 时间 样品编号 取样地点 玉米植株状况（1 矮化、 2 叶片失绿、3 茎基部 开裂） 备注 3 DB23/T 2989—2021 附 录 B （资料性） 线虫形态特征测计值 B.1 线虫形态特征测计值参见表B.1。 表B.1 线虫形态特征测计值 测量指标 雌虫 雄虫 n 13 13 L（μm） 861.4～1032.9 820.5～993.1 a 33.2～38.1 31.8～38.6 b 5.7～6.9 5.3 ～ 5.8 c 13.1～16.2 11.3～15.9 c' 2.9～3.5 3.1～4.3 V 43.5～58.2 St（μm） 26.1～28.9 DGO（μm） 2.0～4.9 T（μm） 57. 2～73.8 R 30 ～40 25.4～28.1 55.6～77.1 SL（μm） 24.1～31.0 GL（μm） 9.0～16.1 4 DB23/T 2989—2021 附 录 C （资料性） 长岭发垫刃线虫（T. changlingensis）进化树 C.1 长岭发垫刃线虫（T. changlingensis）进化树示意图参见图C.1。 图C. 1 长岭发垫刃线虫（T. changlingensis）进化树 5