ICS 65.120 B 46 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1938—2020 饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光 PCR 检测方法 Duplex real-time PCR assay for Salmonella and Serratia in feeds 2020 - 09 - 29 发布 福建省市场监督管理局 2020 - 12 - 29 实施 发 布 DB35/T 1938—2020 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 缩略语 ............................................................................ 1 4 检测原理 .......................................................................... 1 5 主要仪器 .......................................................................... 2 6 培养基和试剂 ...................................................................... 2 7 样品的采集和制备 .................................................................. 2 8 操作步骤 .......................................................................... 2 9 检测过程中防止交叉污染的措施 ...................................................... 4 附录 A（规范性附录） 培养液的配制 .................................................... 5 I DB35/T 1938—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国福州海关提出并归口。 本标准起草单位：福州海关技术中心、海口海关技术中心、福建农林大学动物科学学院、厦门瑞德 利校准检测技术有限公司。 本标准主要起草人：王武军、张体银、吴山楠、阮靖华、郑腾、俞道进、郑晶、白泉阳、王莹莹、 张志灯、于师宇、林杰。 II DB35/T 1938—2020 饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光PCR检测方法有关的检测原理、主要仪器、培养 基和试剂、样品的采集和制备、操作步骤、检验过程中防止交叉感染的措施。 本标准适用于饲料中沙门菌和居泉沙雷菌的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的测定 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Real-time PCR：荧光PCR（Real-time Polymerase Chain Reaction） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid） Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的荧光阈值时所经历的循环数（Cycle Threshold Value） 4 4.1 检测原理 用非选择性液体培养基预增菌 将饲料样品接种到缓冲蛋白胨水，在36 ℃±1 ℃条件下培养16 h～20 h。 4.2 在选择性培养基上增菌 将4.1中的培养物接种到亚硒酸盐胱氨酸培养基和氯化镁-孔雀绿培养基中，分别于36 ℃±1 ℃、 42 ℃±1 ℃条件下培养24 h。 4.3 提取 DNA 进行实时荧光 PCR 检测和判断 提取4.2中培养物的DNA。采用TaqMan方法，分别设计针对沙门菌属和居泉沙雷菌的特异性引物和特 异性的荧光探针进行配对。当样品中含有沙门菌或居泉沙雷菌时，前增菌后提取的细菌DNA通过PCR成指 数扩增，在反应过程中沙门菌特异的荧光探针跟靶核酸杂交，同时被Taq酶水解，把探针上的荧光基团 和淬灭基团分开，游离的荧光基团信号被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号 的增长呈对应关系。从而通过荧光增量来实时判断沙门菌和居泉沙雷菌的存在与否。 1 DB35/T 1938—2020 5 主要仪器 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。 振荡器。 电子天平：感量 0.1 g。 无菌锥形瓶：容量 500 mL、250 mL。 单道可调移液器：容量 0.2 μL～1 mL。 生物安全柜。 荧光 PCR 仪。 冷冻离心机。 高压灭菌器。 培养基和试剂 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 水：应符合 GB/T 6682 中三级水的要求。 缓冲蛋白胨水（BPW）：配制方法按照附录 A 中的 A.1。 氯化镁-孔雀绿（RV）增菌液：配制方法按照附录 A 中的 A.2。 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：配制方法按照附录 A 中的 A.3。 商品化的实时荧光 PCR 预混液。 商品化的细菌基因组 DNA 提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。 沙门菌荧光 PCR 检测用引物（对）和探针序列为： invA-F：5'-ATGGAAGCGCTCGCATTGTG-3' invA-R：5'-GGCTGAGGAAGGTACTGCCA-3' invA-P：5'-JOE-TGCTCGTAATCCGCCGCCATTGGCG-BHQ1-3' 扩增片段为199 bp，用ddH2O溶解至10 μmol/L后，保存于-20 ℃备用。 6.8 居泉沙雷菌荧光 PCR 检测用引物和探针序列为： gyrB-F：5'-TCGGTGAAACCGATCAGAC-3' gyrB-R：5'-GCCAGGATGTCGTACTCAAA-3' gyrB-P：5'-FAM-CTGCGCTTCTGGCCGAGCTT-BHQ1-3' 扩增片段为94 bp，用ddH2O溶解至10 μmol/L后，保存于-20 ℃备用。 7 样品的采集和制备 样品的采集和制备按照GB/T 13091的规定进行。 8 操作步骤 8.1 前增菌 无菌条件下称取25 g样品，加入装有225 mL灭菌BPW（6.2）的500 mL无菌锥形瓶内，置于振荡器中， 以8 000 r/min～10 000 r/min振荡2 min～3 min，于36 ℃±1 ℃条件下培养18 h±2 h。 2 DB35/T 1938—2020 8.2 选择性增菌 取8.1中的前增菌培养物1 mL，接种于装有10 mL RV（6.3）的试管中，于42 ℃±1 ℃培养24 h。 另取8.1中的前增菌培养物1 mL，接种于装有10 mL SC（6.4）的试管中，于36 ℃±1 ℃条件下培养24 h。 8.3 8.3.1 提取 DNA 进行实时荧光 PCR 检测 样品 DNA 提取 8.3.1.1 应在样本处理区进行。取 n 个 1.5 mL 灭菌离心管，其中 n 为待检样品数和阴性、阳性对照数 的总和，对每个管进行编号标记。 8.3.1.2 取 8.2 中的选择性增菌培养物各 1 mL 分别加入 2 个 1.5 mL 灭菌离心管中，10 000 r/min 离 心 5 min，弃上清，加入 50 μL DNA 提取液，充分混匀后沸水浴 5 min，13 000 r/min 离心 5 min，取 上清液进行检测或保存于-20 ℃待检。 8.3.2 扩增试剂的准备和配制 将PCR反应液平衡至室温，在反应混合物配制区按表1的规定进行配制和分装，每个样品建立20 μL 反应体系。 表1 8.3.3 二重 Real-time PCR 反应体系 试剂 使用量/反应体系 Premix Ex TaqTM（2×） 10 μL invA-F（10 μmol/L） 0.4 μL invA-R（10 μmol/L） 0.4 μL invA-P（10 μmol/L） 0.4 μL gyrB-F（10 μmol/L） 0.4 μL gyrB-R（10 μmol/L） 0.4 μL gyrB-P（10 μmol/L） 0.4 μL 无 RNA 酶的 ddH2O 5.6 μL DNA 模板 2 μL 总体积 20 μL 加样 应在加样区进行。在每个PCR反应管中分别加入8.3.1中提取的样品DNA或阴性对照、阳性对照各2 μL， 盖紧管盖，500 r/min离心30 s。 8.3.4 二重荧光定量 PCR 方法的反应条件 应在检测区进行。将8.3.3中加样后的PCR管放入荧光PCR仪内，记录相应样品摆放顺序。设定采集 JOE、FAM荧光信号。反应参数：95 ℃：30 s，1个循环；95 ℃：5 s，64 ℃：30 s（信号采集），40 个循环。反应体系设为20 μL。 3 DB35/T 1938—2020 8.3.5 8.3.5.1 结果判定 结果分析条件设定 结果分析时基线确定：取3～l5个循环的荧光值，设定阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。 8.3.5.2 质控标准 阴性对照无Ct值显示或Ct值为40，阳性对照Ct值≤30.0，并且出现典型的S型扩增曲线，否则视为 无效实验。 8.3.5.3 结果描述及判定 检测样品Ct值≤35.0且有典型S型扩增曲线时，报告沙门菌或居泉沙雷菌核酸阳性/25 g。 检测样品Ct值为零或Ct值＞35.0时，报告沙门菌或居泉沙雷菌核酸未检出/25 g。 对于