ICS 11.220 B 41 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3273—2020 猪伪狂犬病毒野毒株与 gE 基因缺失疫苗株 TaqMan 实时荧光定量 PCR 鉴别方法 A TaqMan Real-time PCR Method for Differentiation of Wild-type Strain from gE-deleted Vaccine Strain of Pseudorabies Virus 2020 - 06 - 30 发布 辽宁省市场监督管理局 2020 - 07 - 30 实施 发 布 DB21/T 3273—2020 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 缩略语 ............................................................................ 1 4 仪器和耗材 ........................................................................ 1 5 试剂和材料 ........................................................................ 1 6 样品采集、处理和运输 .............................................................. 2 7 荧光 qPCR 操作程序 ................................................................. 3 8 结果判定 .......................................................................... 4 附录 A（规范性附录） 溶液配制 ........................................................ 6 附录 B（规范性附录） 引物和探针 ...................................................... 7 I DB21/T 3273—2020 前 言 本标准根据GB/T 1.1-2009的有关规定进行制定。 本标准由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。 本标准负责起草单位：辽宁省农业发展服务中心。 本标准起草人：兰德松、顾贵波、周维、杨洺扬、李可心、孙世宇、张健、刘贺、李旭、高原、丁 静。 本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862 标准起草单位通讯地址：辽宁省农业发展服务中心（沈阳市皇姑区宁山东路29号），联系电话： 024-88420057 II DB21/T 3273—2020 猪伪狂犬病毒野毒株与 gE 基因缺失疫苗株 TaqMan 实时荧光定量 PCR 鉴别方法 1 范围 本标准规定了猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）野毒株及gE基因缺失毒株的TaqMan荧光PCR 检测方法。 本标准适用于猪血液、组织脏器、精液、鼻腔拭子和细胞培养物等材料中PRV核酸的检测以及PRV 野毒株与gE基因缺失疫苗株病毒核酸的鉴别检测。 本标准的实验操作应在生物安全II级实验室（BSL-2实验室）中进行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 gD 糖蛋白D（glycoprotein D） gE 糖蛋白E（glycoprotein E） PRV 伪狂犬病病毒（pseudorabies virus） 4 4.1 仪器和耗材 仪器 荧光PCR仪、高速冷冻离心机（可控温至4 ℃，离心速度可达12 000r/min以上）、组织研磨仪 或研钵、自动化核酸提取仪（如选用商品化核酸提取试剂盒）、PCR微量离心机、2 ℃～8 ℃普通冰箱、 -20 ℃以下普通冰箱、-70 ℃以下超低温冰箱、移液器（量程0.1 μL～2 μL、2 μL～20 μL、20 μL～ 200 μL）。 4.2 耗材 无菌无DNA酶的1.5 mL离心管、0.2 mL PCR反应管或八联管或96孔反应板、与移液器匹配的吸头。 5 试剂和材料 1 DB21/T 3273—2020 5.1 DNAzol® Reagent：商品化 DNA 提取试剂，2 ℃～8 ℃普通冰箱中保存；或商品化核酸提取试剂 盒（如磁珠法核酸提取试剂），通常 18 ℃～25 ℃保存。 5.2 无水乙醇：-20 ℃普通冰箱中预冷。 5.3 75%乙醇：用无水乙醇和双蒸水配制，-20 ℃普通冰箱中 预冷。 5.4 PBS：磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L pH7.2），配制见附录 A。 5.5 8 mmol/L NaOH 溶液，配制见附录 A。 5.6 2×TaqMan Fast qPCR Master Mix：为商品化探针法实时荧光 PCR 反应专用试剂，包含反应所需的缓 冲液、酶、dNTP、Mg+等的预混液，-20 ℃普通冰箱中保存，避免反复冻融。 5.7 引物和 TaqMan 探针，序列见附录 B。 5.8 阳性对照和阴性对照：阳性对照使用 PRV 野毒株细胞培养物、Bartha-K61 疫苗毒，阴性对照采用灭 菌双蒸水或健康猪的组织材料。 5.9 6 除非另有说明，在检测中所用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。 样品采集、处理和运输 6.1 采样前准备 6.1.1 采样人员 参照NY/T 541中第5.1条的要求。 6.1.2 采样工具和器材 参照NY/T 541中第6.10.3条的要求。 6.2 样品采集 6.2.1 血液：参照 NY/T 541 中第 6.1 条中猪血液样品采集的要求进行，将采集的血液注入含 1/10 体积 4 %EDTA 溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备检。 6.2.2 组织脏器：参照 NY/T 541 中第 6.2 条和 6.3 条中的要求进行，将采集的病死猪或剖杀猪主要脏器（脑 组织、三叉神经节、扁桃体、肺脏、淋巴结等）或活体采集的扁桃体装入灭菌的 15 mL～50 mL 离心管中， 编号备检；组织脏器使用组织研磨仪或研钵进行处理后用于核酸提取。 6.2.3 精液：参照 NY/T 541 中第 6.10.3 条中的要求进行。 6.2.4 鼻腔拭子：参照 NY/T 541 中第 6.4 条中的猪鼻腔拭子采集要求进行，将拭子样品放入 PBS 缓冲液（0.02 mol/L pH7.2）中，编号备检。 6.2.5 细胞培养物：细胞培养物反复冻融 3 次，第 3 次解冻后，4 ℃ 4 000 g 离心 10 min，取上清转入新 的无菌无 DNA 酶的 1.5 mL 离心管中，编号备用。 6.3 样品保存、包装和废弃物处理 参照NY/T 541中第7条的要求。 2 DB21/T 3273—2020 6.4 样品运输 参照NY/T 541中第9条的要求。 7 荧光 qPCR 操作程序 7.1 DNA 提取 在实验室的核酸提取区进行。 7.1.1 DNAzol 手工提取 7.1.1.1 编号。 取 n 个无菌无 DNA 酶的 1.5 mL 离心管，n 为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行 7.1.1.2 每管加入 800 μL DNAzol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各 200 μL，颠倒混匀，室 温静置 5 min；4℃ 10 000 g 离心 10 min。 7.1.1.3 取 900 μL 上清，转入新的无菌无 DNA 酶 1.5 mL 离心管中，加入 500 μL 预冷的无水乙醇，颠倒 混匀，室温放置 3 min；4℃ 10 000 g 离心 5 min。 7.1.1.4 弃上清，沿管壁缓慢加入 1 mL-20 ℃普通冰箱中预冷的 75 %乙醇，颠倒混匀，4℃ 10 000 g 离 心 5 min。重复洗涤 2 次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器小心移去残液。 7.1.1.5 7.1.2 用 50 μL 8 mmol/L NaOH 溶液溶解沉淀，DNA 在-20 ℃以下保存备用。 核酸提取仪提取 7.1.2.1 按照与核酸提取仪匹配的核酸提取试剂盒说明书提取。 7.1.2.2 将提取的 DNA 转入新的无菌无 DNA 酶的 1.5 mL 离心管中，在-20℃以下普通冰箱中保存备用。 7.2 7.2.1 荧光 qPCR 检测 反应体系的配制和分装 在试剂配制区进行。gD基因和gE基因的反应体系相同。设荧光qPCR反应管数为n，n为待检样品数+ 阳性对照管数+阴性对照管数，每个反应体系见表1，配制体系时建议按照n+1个反应进行配制，配制反 应体系建议在冰盒中进行；配制好的反应液充分混匀后，按照每管18 μL 分装于PCR反应管内，并做好 标识。 表1 每个反应体系配制表 7.2.2 组分 用量 2×TaqMan Fast qPCR Master Mix 10 μL 上游特异性PCR引物（10 μmol/L） 0.5 μL 下游特异性PCR引物（10 μmol/L） 0.5 μL TaqMan探针（10 μmol/L） 0.5 μL 灭菌双蒸水 6.5 μL 总体积 18 μL 加样 3 DB21/T 3273—2020 在核酸提取区进行