ICS 65.120 B 46 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 4000—2020 羊 A 型产气荚膜梭菌 PCR 和 ELISA 检测技术 规程 Technical specification for detection of sheep clostridium perfringens by PCR and ELISA 2020 - 06 - 08 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 07 - 08 实施 发 布 DB37/T 4000—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心。 本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、闫振贵、彭军、胡莉萍、黄河、杨萍萍、柳洪洁、曹振山、王 敏、王世荣、郝长宝。 I DB37/T 4000—2020 羊 A 型产气荚膜梭菌 PCR 和 ELISA 检测技术规程 1 范围 本标准规定了羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测方法的技术规范。 本标准适用于羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14925 实验动物 环境及设施 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 一抗 酶联免疫吸附试验（ELISA）中用于与包被的抗原结合的抗体称为一抗。阴阳性血清和待检血清统 称为一抗。 3.2 二抗 酶联免疫吸附试验（ELISA）中用于与一抗结合的抗抗体称为二抗。本标准中兔抗羊IgG抗体为二抗。 4 试剂或材料 4.1 产气荚膜梭菌 使用A型产气荚膜梭菌标准株CVCC41。 4.2 产气荚膜梭菌阳性血清 羊经免疫产气荚膜梭菌抗原3次后获得的血清，每次免疫间隔两周。抗体中和试验检测效价高于 1:256（附录A）。 4.3 阴性血清 从健康的未感染未免疫的羊分离的血清（附录A）。 1 DB37/T 4000—2020 4.4 生化试剂 灭菌0.5%石炭酸生理盐水、PBS、PBST、Tris-HCL、牛血清白蛋白（BSA）、底物反应液（具体配制 方法见附录B）；PCR buffer；dNTP；Taq 聚合酶；溴酚蓝；二甲苯青；蔗糖；Tris-乙酸；乙二胺四乙 酸（EDTA）；溴化乙锭；琼脂糖；Tween-20；考马斯亮蓝G-250；考马斯亮蓝R-250；邻苯二胺（OPD）； 30%丙烯酰胺；十二烷基硫酸钠（SDS）；过硫酸铵（AP）；四甲基乙二胺（TEMED）；甲醛溶液；FT培 养基；产毒培养基；酵母浸膏粉；蛋白胨；L-精氨酸；糊精。 4.5 水 试验用水符合GB/T 6682三级水的规定。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 微量移液器：量程为 20 μL～100 μL。 PCR 管：200 μL 体积。 灭菌吸管：1.0 mL。 恒温培养箱。 匀速振荡器。 离心机：转速不低于 16000 r/min。 96 孔 ELISA 酶标板。 PCR 仪。 酶标仪：波长范围 340 nm～850 nm。 分光光度计。 玻璃比色皿。 6 产气荚膜梭菌 PCR 检测方法 6.1 本检测方法在 200 μL 的离心管中进行，所使用的引物如下： 表1 产气荚膜梭菌 PCR 引物序列 Primers Primer sequence (5’-3’) CPA-F TATGAATGGCAAAGAGGA CPA-R ACTAAAATACTGACCTTC Size (bp) 589 6.2 所用的上样缓冲液为：质量/体积比为 0.25％的溴酚蓝，质量/体积比为 0.25%的二甲苯青，质量/ 体积比为 40%的蔗糖水溶液。 6.3 所用的含溴化乙锭的琼脂糖凝胶为由 0.04 M 的 Tris-乙酸和 0.001M 的乙二胺四乙酸（EDTA）组 成的 TAE 缓冲液配制的，其中含 0.5 μg/mL 的溴化乙锭和质量/体积比为 1.5%琼脂糖。 6.4 试验步骤如下： a) 将过夜培养的病原菌，采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒抽提细菌的基因组 DNA； b) 以上述细菌基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 扩增反应体系（50 μL）为：10×PCR buffer （含 Mg2+）5.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL、Taq 聚合酶 0.3 μL、模板为 2.0 μL、引物浓 度为 10 pmol/μL，用补齐至 50 μL； 2 DB37/T 4000—2020 c) d) PCR 扩增反应条件为：预变性 94℃ 7 min；94℃ 变性 30 s、56℃ 退火 30 s、72℃ 延伸 45 s， 30 个循环；产物末端 72℃延伸 10 min； PCR 扩增产物加入上样缓冲液后，再加样于含 0.5 μg/mL 溴化乙锭的 1.5％琼脂糖凝胶中，进 行琼脂糖凝胶电泳检测。 6.5 结果判定 紫外成像仪下观察PCR产物凝胶电泳，如果出现589 bp的目的条带（如图1），则判定为产气荚膜梭 菌。 图1 PCR 目的条带图示 注：M代表 DNA Marker；1, 2, 3, 4代表检测样本。 7 ELISA 检测方法 7.1 包被 包被：将产气荚膜梭菌α毒素蛋白用包被液（0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释成10 μg/mL， 包被酶标板。 7.2 封闭 用PBST洗涤酶标板5次。每孔加入封闭液（含1% BSA的PBS）200 μL，置于湿盒内，4℃封闭过夜。 7.3 一抗孵育 用PBST洗涤酶标板5次。取1孔加入1:10倍稀释羊抗产气荚膜梭菌α毒素高免血清作为阳性对照（制 备方法见附录B），取1孔加入1:10倍稀释的羊阴性血清作为阴性对照（制备方法见附录B）；其它孔加 1:10稀释的待检血清，置湿盒内37℃作用60 min。抗体稀释液为1℅ BSA的PBS。 7.4 二抗孵育 用PBST洗涤酶标板5次。加入1:5000稀释的HRP标记的兔抗羊IgG（抗体稀释液为1℅ BSA的PBS）， 置湿盒内37℃作用45 min。 7.5 底物显色 用PBST洗涤酶标板5次。加底物反应液，置湿盒内37℃避光显色20 min。 3 DB37/T 4000—2020 7.6 读数 最后用2.0 mol/L的H2SO4溶液终止反应，以酶标仪检测样品的OD490值。 7.7 结果判定 以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2倍者，即P/N大于或等于2判为阳性，重复3次计算平均值。 4 DB37/T 4000—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 羊产气荚膜梭菌α毒素的提取和抗血清的制备 A.1 羊产气荚膜梭菌α毒素蛋白的提取 A.1.1 将保存的羊A型产气荚膜梭菌标准株（CVCC41）接种于200 mL FT培养基中进行增菌，37℃厌氧 培养 12 h。 A.1.2 将增菌液以5%的比例接种到产毒培养基（配制方法见附录A）中，43℃厌氧培养 5 h-6 h 进行 产毒。产毒结束，离心（12000 r/min，30 min） 取上清，离心后用 0.22 µm 的滤器过滤取上清。 A.1.3 将过饱和硫酸铵溶液缓慢加入到上述所制得上清中，使其终浓度达到40%，4℃静置过夜。 A.1.4 离心（10000 r/min，20 min）保留沉淀，用同体积的含2% Triton X-100的Tris-MgCL2缓冲液 溶解。 A.1.5 溶解完成后，向管内加入过饱和硫酸铵溶液使其终浓度为40%，再次离心方法同上，最后取 3. 0 mL 0.05M 的Tris-HCL 缓冲液（PH=7.5）溶解沉淀。 A.2 羊产气荚膜梭菌α毒素蛋白含量测定 A.2.1 采用Bradford方法，具体操作步骤如下： a) 取 16 支试管，1 支作空白，3 支留作未知样品，其余试管分为两组，分别加入样品、水和试剂， 即用 1.0 mg/mL 的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0 mL、0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、 0.06 mL、0.08 mL、0.1 mL，然后用无离子水补充到 0.1 mL； b) 最后各试管中分别加入 5.0 mL 考马斯亮兰 G-250 试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混 合（不能太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）； c) 加完试剂 2 min-5 min 后，即可开始用玻璃比色皿，在分光光度计上测定各样品在 595 nm 处 的光吸收值 A595，空白对照为第 1 号试管，即 0.1 mL 水加 5.0 mL 考马斯亮兰 G-250 试剂。 比色皿使用后立即用少量 95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时 间浸泡； d) 用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值 A595 为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。 由此标准曲线，根据测出的未知样品的 A595 值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5 mg 牛 血清蛋白/mL 溶液的 A595 约为 0.50。 A.2.2 微量法： 当样品中蛋白质浓度较稀时（10 mg/mL-100 mg/mL），可将取样量（包括补加的水）加大到0.5 mL 或1.0 mL，空白对照则分别为0.5 mL或1.0 mL水，考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0 mL, 同时作相应的标 准曲线，测定595 nm的光吸收值。0.05 mg牛血清蛋白/mL溶液的A595约为0.29。 A.3 羊产气荚膜梭菌α毒素聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测 A.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）采用解离非连续缓冲系统垂直板电泳。 A.3.2 使用浓缩胶为5%，分离胶为12%的不连续聚丙烯酰胺凝胶（附录B）。 5 DB37/T 4000—2020 A.3.3 电泳结束，采用考马斯亮蓝R-250染色，以标准低蛋白分子量的对数值和电泳迁移率绘制标准曲 线，求出各蛋白分子量。 A.4 产气荚膜梭菌α毒素抗血清的制备 A.4.1 将甲醛缓慢的加入到含有α毒素的溶液中使甲醛终浓度达到 0.3%，混匀后，在37℃条件下将外 毒素灭活 96 h，期间每隔 5 h-6 h 振荡一次混合液。 A.4.2 将灭活的羊产气荚膜梭菌α毒素蛋白液与弗氏不完全佐剂混合（V:V=1:1） ，用漩涡振荡器乳化， 制备羊产气荚膜梭菌α毒素免疫用抗原。 A.4.