ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4032—2020 非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范 Technical specification for isothermal amplification detection of African swine fever 2020 - 07 - 09 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 08 - 09 实施 发 布 DB37/T 4032—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所、山东师范大学、中国动物卫生与流行病学中 心、山东鼎科检测技术有限公司、潍坊安普未来生物科技有限公司、上海基灵生物科技有限公司、潍坊 汉森生物饲料科技有限公司。 本标准主要起草人：孙文博、吴家强、陈蕾、殷斌、陈智、吴晓东、蒋文明、刘国宪、郑乾坤、李 敏、杜以军、于江、时建立、吴香菊、李俊、丛晓燕、郭立辉。 I DB37/T 4032—2020 非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范 1 范围 本标准规定了非洲猪瘟病毒（ASFV），英文缩略表见附录D，核酸的重组酶聚合酶扩增（RPA）检测 技术的要求。 本标准适用于非洲猪瘟的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 核酸恒温扩增技术是依赖解旋酶解开双链DNA，依赖单链DNA结合蛋白与模板单链结合，使模板处于 单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶的催化下开始扩增。 4 试剂或材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。 水：GB/T 6682，一级水。 1×PBS 溶液(pH 值 7.4)：配制见附录 A.1。 核酸提取试剂： a) 蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL）：配制见附录 A.2； b) 10 %十二烷基硫酸钠（SDS 溶液，pH7.2）：配制见附录 A.3； c) Tris 平衡酚； d) 三氯甲烷； e) 70 %乙醇：配制见附录 A.4。 重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒。 DEPC 水。 恒温扩增检测的引物：恒温扩增检测引物见附录 B.1。 无水乙醇。 微量移液器配套的带滤芯吸头。 离心管：1.5 mL。 5 主要仪器设备 1 DB37/T 4032—2020 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 微量移液器：最大量程分别为 10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。 生物安全柜。 普通冰箱。 涡旋振荡器。 研磨管。 荧光定量 PCR 仪：Peltier 加热，≥16 孔（0.2 mL，2×8 联管和单管）。 电子天平：感量为 0.001 g。 低温高速台式离心机：离心力≥8 000 g。 6 样品 6.1 基本要求 应符合GB 19489—2008和NY/T 541—2016中关于实验室生物安全和兽医诊断样品采集、保存与运输 的要求。 6.2 样品采集 6.2.1 棉拭子样品 无菌操作，采集猪口腔拭子。 6.2.2 组织样品 无菌操作，取猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2 ℃～8 ℃低温运至实验室。 6.2.3 环境样品 相关场所的粪便、饲料、污水样品。2 ℃～8 ℃低温运至实验室。 6.3 样品处理 6.3.1 口腔拭子样品处理 口腔拭子管6 000 r/min震荡45 s，取200 μL进行核酸提取。 6.3.2 脾、肺、肾等组织样品处理 取0.05 g组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6 000 r/min震荡研磨45 s，制成约10 %的组织匀 浆液，5 000 g离心5 min，取200 μL上清液进行核酸提取。 6.3.3 粪便、饲料样品处理 取1 g粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6 000 r/min震荡研磨45 s，制成约10 %的匀浆 液，5 000 g离心5 min，取200 μL上清液进行核酸提取。 6.3.4 污水样品处理 取200 μL污水进行核酸提取。 7 操作步骤 2 DB37/T 4032—2020 7.1 取 6.2 处理后的样品 500 μL 加入 10 %SDS 溶液 50 μL、20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液 10 μL，于 55 ℃ 水浴 2 h～3 h。 7.2 加入 200 μL Tris 平衡酚，混匀，4 ℃ 12 000 g 离心 15 min。 7.3 取上清液 500 μL，加入 200 μL Tris 平衡酚和 200 μL 三氯甲烷，4 ℃ 12 000 g 离心 15 min。 7.4 取上清液 400 μL，加入 200 μL 三氯甲烷，4 ℃ 12 000 g 离心 15 min。 7.5 取上清液 300 μL，加入 2 倍体积的无水乙醇，-20 ℃静置 20 min，4 ℃ 12 000 g 离心 15 min。 7.6 弃上清液，加入 1 mL 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。 7.7 加入 20 μL 灭菌一级水溶解沉淀，-20 ℃保存备用。 7.8 也可选择市售商品化 DNA 提取试剂盒，完成 DNA 的提取。 7.9 设 50 μL 反应体系，详见附录 B.2。 7.10 每次反应设置试验中同时质粒 DNA 作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。具体反应程序见附 录 B.3。 8 结果判定 8.1 结果判读见表 1。 表1 结果判定 序号 通道 Ct 值 结果判断 1 FAM 未检测到或 40 样本核酸浓度低于检测限，报告为阴性 2 FAM ≤37 报告为阳性 3 FAM 37-40 复检一次，如仍为 37-40，则报告为阴性 8.2 阴性对照和阳性对照，有任一结果异常，需要重新检测。 8.3 结果参考图谱：见附录 C.1。 3 DB37/T 4032—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 1×PBS溶液(pH值 7.4) 磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27 g。 磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42 g。 氯化钠(NaCl)：8 g。 氯化钾(KCl)：0.2 g。 加灭菌水约800 mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH值至7.4，最后定容到1 L。 A.2 蛋白酶K溶液(20 mg/mL) 蛋白酶K 灭菌一级水 100 mg 5 mL A.3 10 %十二烷基硫酸钠(SDS溶液，pH7.2) 十二烷基硫酸钠 灭菌一级水 浓盐酸 灭菌一级水 10 g 80 mL 调pH至7.2 加至100 mL A.4 70 %乙醇 无水乙醇 灭菌一级水 4 70 mL 30 mL DB37/T 4032—2020 BB 附 录 B （规范性附录） 恒温核酸扩增引物、反应液体系与反应条件 B.1 恒温核酸扩增引物 见表B.1。 表B.1 恒温核酸扩增引物 引物 序列 Asfv-F 5’- CTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAC-3’ Asfv-R 5’- GAGATACAGCTCTTCCAGAYGCATGTTCATC -3’ Asfv-Probe 5’-AGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAACTTA[F]C[T]A[B]AAGATTGATACCATG-3’ 注：[F]为FAM荧光基团标记、[T]为THF、[B]为BHQ1淬灭基团标记、3’末端为C3 Spacer标记。 B.2 恒温核酸扩增反应液体系 见表B.2。 表B.2 恒温核酸扩增反应液体系 用量 组分 μL DEPC 水 8.5 A Buffer 29.4 10 μM 上游引物 2 10 μM 下游引物 2 10 μM 探针 0.6 模板 DNA 5 B Buffer 2.5 B.3 恒温核酸扩增反应条件 见表B.3。 表B.3 恒温核酸扩增反应条件 反应条件 反应温度 39 ºC 循环数 40 信号采集 每 30S 反应时间 20 min 5 DB37/T 4032—2020 CC 附 录 C （规范性附录） 样品检测结果图 样品检测结果见图C.1。 图C.1 样品检测结果图 6 DB37/T 4032—2020 DD 附 录 D （规范性附录） 英文缩略表 英文缩略表见表D.1。 表D.1 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名 ASFV African swine fever virus 非洲猪瘟病毒 RPA Recombinase polymerase amplification 重组酶聚合酶扩增 PBS phosphate buffer saline 磷酸缓冲盐溶液 DEPC diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 _________________________________ 7