ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4052—2020 小反刍兽疫恒温扩增检测技术规范 Technical specification for isothermal amplification of Peste des petits ruminants 2020 - 07 - 09 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 08 - 09 实施 发 布 DB37/T 4052—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东师范大学、山东省农业科学院、中国动物卫生与流行病学中心、杭州众测生 物科技有限公司、桂林市临桂区动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：陈蕾、孙文博、吴晓东、陈艳如、廖炳次、蒋文明、李华、刘腾腾、杨慧婷、 单世娟、陈秋红、孙晓洁、杨桂文。 I DB37/T 4052—2020 小反刍兽疫恒温扩增检测技术规范 1 范围 本标准规定了小反刍兽疫（PPR）的恒温核酸扩增检测技术的要求。 本标准适用于小反刍兽疫的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489—2008 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541—2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 原理 核酸恒温扩增技术是依赖解旋酶解开双链DNA，再依赖单链DNA结合蛋白与模板单链结合，使模板单 链处于单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶的催化下扩增。 4 试剂或材料 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。 水：符合 GB/T 6682 中规定的一级水。 1×PBS 溶液（pH 值 7.4）配制见附录 A.1。 核酸提取试剂： a) Trizol； b) 氯仿； c) 75 %乙醇； d) 异丙醇。 恒温扩增试剂盒。 不含 RNA 酶的水：DEPC 处理过的不含 RNA 酶的水。 恒温扩增检测引物：恒温扩增检测引物表 B.1。 无水乙醇。 微量移液器配套的带滤芯吸头。 离心管：1.5 mL。 5 材料及设备 4.1 4.2 4.3 1 DB37/T 4052—2020 主要仪器设备： a) 微量移液器：10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL； b) 高速台式离心机：离心力≥8 000 g； c) 生物安全柜； d) 冰箱； e) 涡旋振荡器； f) 研磨管； g) 荧光定量 PCR 仪； h) 天平：感量为 0.001 g。 6 样品 6.1 基本要求 应符合GB 19489—2008和NY/T 541—2016中关于实验室生物安全和兽医诊断样品采集、保存与运输 的要求。 6.2 样品采集 6.2.1 棉拭子样品 无菌采集羊口鼻棉拭子。 6.2.2 组织样品 无菌采集病死羊的淋巴结、脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织样品。2 ℃～8 ℃低温运至实验室用于检 测。 6.2.3 环境样品 采集与病羊相关场所的粪便、饲料、污水样品。2 ℃～8 ℃低温运至实验室。 6.3 样品处理方法 6.3.1 口鼻拭子样品处理 口鼻拭子管6 000 g震荡45秒，取200 μL进行核酸提取。 6.3.2 淋巴结、脾、胸腺等组织样品处理 取0.05 g组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6 000 g震荡研磨45秒，制成约10 %的组织匀浆液， 5 000 g离心5 min，取200 μL上清液进行核酸提取。 6.3.3 粪便、饲料样品处理 取1 g的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6 000 g/min震荡研磨45秒，制成约10 %的匀 浆液，5 000 g/min离心5 min，取200 μL上清液进行核酸提取。 6.3.4 污水样品处理 取200 μL污水进行核酸提取。 2 DB37/T 4052—2020 7 操作步骤 7.1 RNA 的提取–Trizol 法 7.1.1 取 6.2 处理后的样品向处理好的 300 μL 组织样品或血清中加入 800 μL Trizol，重复吹打以 裂解细胞（或者剧烈振荡），冰上放置 10 min～25 min。 7.1.2 加入氯仿 200 μL，用力振荡 30 s，室温放置 5 min。 7.1.3 4 ℃，8 000 g 离心 15 min，吸取上层液体 500 μL 于 1.5 mL 离心管中。 7.1.4 加入 1.0 mL 异丙醇，-20 ℃沉淀 RNA 至少 1 h。 7.1.5 4 ℃ 8 000 g 离心 10 min，弃上清，用 75 %的乙醇洗涤沉淀，8 000 g 离心 5 min，彻底弃去 上清，自然条件下干燥沉淀，溶于 50 μL DEPC 处理的灭菌水中，-20 ℃贮存，备用。也可选择市售商 品化 RNA 提取试剂盒，完成 RNA 的提取。 7.2 恒温核酸扩增 设50 μL恒温核酸扩增反应体系，详见附录B.2。 7.3 检测 每次反应设置阳性、阴性对照，具体反应程序见表B.3。 8 结果判定 8.1 结果判读见表 1。 表1 结果判定 序号 通道 Ct 值 结果判断 1 FAM UNDET 或 40 样本低于检测限，报告为阴性 2 FAM ≤37 判定为阳性 3 FAM 37-40 复检一次，如仍为 37-40，则判定为阴性 8.2 阴性对照和阳性对照，有任一结果异常，需要重新检测。 8.3 结果参考图谱：见附录 C。 3 DB37/T 4052—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 1×PBS溶液(pH值7.4)： a) 磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27 g； b) 磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42 g； c) 氯化钠(NaCl)：8 g； d) 氯化钾(KCl)：0.2 g。 加灭菌水约800 mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH值至7.4，最后定容到1 L。 4 DB37/T 4052—2020 BB 附 录 B （规范性附录） 恒温核酸扩增引物、反应液体系与反应条件 B.1 恒温核酸扩增引物 见表B.1。 表B.1 恒温核酸扩增引物 引物 序列 PRRV-F 5’- ATCCAACTCTCAAGTACAGCGTTACTATGTTTATA -3’ PRRV-R 5’- TCCACATCGCTGTCGTCAGATCCATCCTCTCCT -3’ 5’- GTGAAGAGATTGAAGGACTCGAGGATGCTGAC (FAM-d T) (THF) (BHQ1-d T) CTCGTGGTTCAAGCA-C3 spacer PRRV-Probe -3’ 注：[F]为FAM荧光基团标记、[T]为THF、[B]为BHQ1粹灭基团标记、3’末端为C3 Spacer标记。 B.2 恒温核酸扩增体系 见表B.2。 表B.2 恒温核酸扩增体系 组分 用量 μL DEPC 水 25.4 A Buffer 12.5 10 μM PRRV-F 2 10 μM PRRV-R 2 10 μM PRRV-Probe 0.6 模板 RNA 5 B Buffer 2.5 涡旋混合并离心上述溶液，装有干粉的反应管用移液器上下吹打直至干粉溶解完全并混合均 匀。 5 DB37/T 4052—2020 B.3 恒温核酸扩增反应条件 见表B.3。 表B.3 恒温核酸扩增反应条件 反应条件 反应温度 39 ºC 循环数 40 信号采集 每 30 s 反应时间 20 min 6 DB37/T 4052—2020 CC 附 录 C （资料性附录） 小反刍兽疫恒温扩增检测结果判读 阴性对照和阳性对照见图C.1。 图C.1 阴性对照和阳性对照 样品检测见图C.2。 图C.2 样品检测 _________________________________ 7