ICS 65.020.30 B 41 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2685—2020 猪伪狂犬病毒交叉引物恒温扩增（CPA） 检测方法 2020 - 7 - 14 发布 四川省市场监督管理局 2020 - 8 - 1 实施 发 布 DB51/T 2685—2020 目 次 前言 ................................................................................. I 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 缩略语 ............................................................................ 1 4 仪器 .............................................................................. 2 5 耗材 .............................................................................. 2 6 试剂 .............................................................................. 2 7 样品采集和处理 .................................................................... 2 8 CPA 操作程序 ....................................................................... 3 9 样品处理及生物安全管控措施 ........................................................ 5 附录 A （规范性附录） 溶液配制 ...................................................... 6 附录 B （规范性附录） 引物 .......................................................... 7 附录 C （规范性附录） CPA 反应体系 .................................................. 8 I DB51/T 2685—2020 前 言 本规范依据GB/T1.1-2009给出的规定进行编写。 本标准由四川省农业农村厅提出归口并负责解释。 本标准由四川省市场监督管理局批准。 本标准由四川省动物疫病预防控制中心、四川纳比生物科技有限公司负责起草。 本标准主要起草人：陈斌、周明忠、陈弟诗、袁旦一、李晓琪、裴超信、张毅、邓飞、李丽、邵靓、 陈冬、蔡冬冬、丁梦蝶、邱明双、周莉媛、张睿、辜良斌。 II DB51/T 2685—2020 猪伪狂犬病毒交叉引物恒温扩增（CPA） 检测方法 1 范围 本标准规定了猪伪狂犬病毒的交叉引物恒温扩增（CPA）检测方法。 本标准适用于四川省行政区域范围内猪伪狂犬病毒核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489-2008 实验室生物安全通用要求 GB/T 25172-2010 猪常温精液生产与保存技术规范 SN/T 3567.1-2013 交叉引物恒温扩增检测方法 第1部分：通用技术规程 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.1 CPA 交叉引物恒温扩增（Crossing Primming Amplification） 3.2 DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribomucleic acid） 3.3 Bst 酶 Bst DNA聚合酶（Bst DNA polymerase） 3.4 TE 缓冲液 Tris-EDTA缓冲液（Tris-EDTA buffer） 3.5 PRV 伪狂犬病毒（pseudorabies virus） 3.6 PBS 磷酸盐缓冲液 1 DB51/T 2685—2020 4 仪器 4.1 恒温金属浴。 4.2 高速台式冷冻离心机。 4.3 组织研磨仪或研钵。 4.4 普通冰箱：2℃～8℃。 4.5 普通冰柜：-20℃以下。 4.6 超低温冰箱：可控温至-70℃。 4.7 微量移液器：0.2μL～2.5μL、2μL～20μL、20μL～200μL、100μL～1000μL，并配备与移液器匹配 的吸头。 4.8 高压灭菌锅。 4.9 干烤灭菌器。 4.10 普通 PCR 仪。 5 耗材 5.1 1.5mL 离心管。 5.2 0.2mLPCR 薄壁管或八连管。 5.3 PCR 管漂浮板。 6 试剂 6.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。 6.2 DNAzol 于 2℃-8℃保存；商品化 DNA 提取试剂按说明书要求条件保存。 6.3 无水乙醇，-20℃预冷。 6.4 75%乙醇，无水乙醇和双蒸水配制，-20℃预冷。 6.5 8mmol/LNaOH 溶液，配制见附录 A。 6.6 PBS 缓冲液，配制见附录 A。 6.7 Bst 酶及 Bst 酶反应缓冲液：Bst 酶浓度为 8U/μL， Bst 酶反应缓冲液为 10×Thermopol* Buffer，Mg2+ 浓度为 100mmol/L。 6.8 dNTP Mix：含 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各 10mmol/L,-20℃保存，避免反复冻融。 6.9 引物序列参见附录 B。 6.10 伪狂犬病毒阳性对照样品和阴性对照样品：阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒，-20℃保 存备用；阴性对照可采用 ddH2O。 6.11 石蜡油，按说明书要求条件保存。 7 样品采集和处理 7.1 采样工具 7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.1.4 2 手术刀、剪刀、镊子，经 160℃干热灭菌 2h 或高压灭菌烘干。 一次性无菌棉拭子。 组织研磨器或者研钵，经 160℃干热灭菌 2h 或高压灭菌烘干。 一次性注射器/真空采血管。 DB51/T 2685—2020 7.2 样品采集 7.2.1 血液样品采集：用含有 EDTA 的真空采血管采集血液，充分混匀，编号备用。 7.2.2 血清样品采集：不含有 EDTA 的真空采血管时，采血后静置析出血清，将血清转入离心管编号 备用。 7.2.3 精液样品采集：按照 GB/T 25172-2010 中第 4、8 章节的方法采集和保存精液。 7.2.4 鼻拭子样品采集：用棉拭子取受检动物鼻腔分泌物，置于 2mlPBS 缓冲液中备用。 7.2.5 组织样品采集：取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、三叉神经节、扁桃体、肺脏、淋巴结等组 织 5-10g，置于无菌离心管内，编号备用。 7.3 样品保存和运输 采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品，在2℃-8℃下保存应不超过24h，-20℃±5℃下 应不超过3个月，-70℃以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输，并在规定温度下的保存期内 送达。 7.4 样品处理 7.4.1 血液和精液样品无需进行前处理，直接用于核酸提取。 7.4.2 鼻拭子样品：充分震荡洗脱含有鼻拭子的管子 1min 左右，弃去拭子后静置 5min，取上清用于 后续的核酸提取。 7.4.3 组织样品：取 2g 左右的组织，剪碎，加入 1-2mlPBS 缓冲液进行研磨至匀浆状态，8000r/min， 离心 1min 取上清用于后续的核酸提取。 8 CPA 操作程序 8.1 DNA 提取试剂 8.1.1 核酸提取区进行操作。DNA 提取使用 DNAzol 手工提取，也可以使用商品化试剂盒提取。 8.1.2 取 n 个灭菌的 1.5ml 离心管，其中 n 为待检样品数量加上阴阳性对照，对每个离心管进行编号。 8.1.3 每管先加入 800μLDNAzol，再分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各 200 μL，颠倒 10 次 混匀，4℃或室温 10000 r/min 离心 10min。 8.1.4 取 900μL 上清，置于新的 1.5ml 离心管中，加入 500 μL 无水乙醇，混匀，室温放置 3min；4℃ 或室温 10000 r/min 离心 5min。 8.1.5 弃上清，沿管壁缓缓加入 0.8mL-1 mL 乙醇，颠倒 3-6 次混匀，4℃ 10000 r/min 离心 5min。反 复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器移去残液。 8.1.6 用 30μL 8mmol/L NaOH 溶液溶解沉淀，DNA 在 2-8℃冰箱可保存两个月，-20℃冰柜可保存 2 年左右。 8.2 CPA 反应 8.2.1 反应体系的配制 在试剂准备区进行。设CPA反应管为n, n为待检样品数量加上阴阳性对照，每个反应的体系见附录 C，为了避免移液器取样损失，建议按n+1反应进行配制。 8.2.2 反应液的分装 3 DB51/T 2685—2020 将8.2.1中配制的CPA反应液充分混匀，按照每管16 μL分装于0.2mL透明PCR管内，按顺序加样并做 好标识，转移至核酸提取区。 8.2.3 加样 在核酸提取区进行。在每个PCR反应管中分别加入8.1制备的DNA核酸溶液4μL，再向每管滴加20μL 石蜡油，盖上盖子，将反应管以大于4000 r/min瞬时离心3-5秒。转移至检测区。 8.2.4 CPA 扩增 方法一：将PCR反应管置恒温设备（水浴锅、金属浴）上，63℃避光温浴35min。 方法一：实验室若暂时无石蜡油，可将PCR管置于普通PCR仪，程序设置热盖105℃，样品孔63℃， 35min。 8.2.5 结果判定 8.2.5.1 操作程序 将恒温扩增后的PCR反应管（不可开盖，以避免污染）放入一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸 条）（按照SN/T 3567.1-2013中附录B操作），检查液泡有无漏液以及是否在下图（图1）所示位置，