ICS 65.020.30 B43 DB63 青 海 省 地 方 标 准 DB 63/ T 1709—2018 牦牛胚胎快速冷冻保存及解冻技术 操作规程 2018 - 12 - 26 发布 青海省市场监督管理局 2019 - 03 - 20 实施 发 布 DB63/T 1709—2018 前 言 本标准依据GB/T 1.1—2009的规则编写。 本标准由青海省农牧业标准化专业技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：青海省畜牧兽医科学院。 本标准主要起草人：徐惊涛、孙永刚、李瑞哲。 I DB63/T 1709—2018 牦牛胚胎快速冷冻保存及解冻技术操作规程 1 范围 本标准规定了牦牛胚胎快速冷冻和解冻的操作方法。 本标准适用于牦牛胚胎生产技术推广应用的规范化操作。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 5458 液氮生物容器 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 25881 牛胚胎 GB/T 26938 牛胚胎生产技术规程 NY/T 1572 牛胚胎移植技术规程 DB63/T 1163 牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牦牛胚胎 yak embryo 通过自然交配、人工授精、体外受精等方式产生的牦牛早期受精卵（受精后6 d～8 d）。 3.2 胚胎快速冷冻 embryo rapid cryopreservation 经过清洗、胚胎冷冻保护剂平衡后，将胚胎直接置入液氮中保存的一种冷冻方法。 3.3 胚胎解冻 thawing of frozen embryo 将冷冻保存的胚胎按照操作程序融化，去除冷冻保护剂，使胚胎恢复活性的过程。 4 4.1 试剂、耗材、设备和实验室要求 试剂、耗材和设备 1 DB63/T 1709—2018 所用的试剂、耗材和设备以及要求见附录A。 4.2 实验室要求 冷冻保存液、解冻液及移植液必须在符合GB 19489相关条款的实验室中配制。 4.3 器具清洗、消毒 所用器具的清洗、消毒见附录B。 5 试剂配制及保存 5.1 试剂配制用水 试剂配制用水按照GB/T 6682中的分级标准采用一级水。 5.2 冷冻保存液 5.2.1 基础液（BS） TCM-199中加入20%胎牛血清（FBS）。 5.2.2 平衡液（ES） TCM-199中加入7.5%乙二醇（EG）、7.5%二甲基亚砜（DMSO）、20%胎牛血清（FBS）。 5.2.3 冷冻液（VS） TCM-199中加入15%乙二醇（EG）、15%二甲基亚砜（DMSO）、0.5 mol/L蔗糖（Su）、20%胎牛血清 （FBS）。 5.3 胚胎解冻液 5.3.1 解冻液（TS） TCM-199中加入1.0 mol/L蔗糖（Su）和20%胎牛血清（FBS）。 5.3.2 稀释液（DS） TCM-199中加入0.5 mol/L蔗糖（Su）和20%胎牛血清（FBS）。 5.4 改进 PBS 液（m-PBS） 改进PBS液（m-PBS）配制见附录C。 5.5 胚胎移植液（TM） m-PBS中加入4 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）和10%胎牛血清（FBS）。 5.6 解冻后胚胎培养液 TCM-199液中加入10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素。 5.7 试剂保存 2 DB63/T 1709—2018 5.7.1 基础液、平衡液、冷冻液、解冻液、胚胎移植液等试剂在无菌操作台中配制，配制后的试剂用 0.22 μm 滤膜过滤除菌后分别装入无菌离心管内，密封管口，在管外标注液体名称、配制日期，存入 0℃～ 4℃冰箱或冷藏箱中保存。 5.7.2 每次装、取液后，均须即时封闭试剂保存管管口。 5.7.3 试剂的使用期限为 7 d 以内。 6 胚胎生产 按照GB/T 26938和DB63/T 1163相关技术操作规程生产。 7 7.1 胚胎冷冻及解冻前准备 胚胎冷冻、解冻操作室 操作室应设在牦牛胚胎采集或移植附近的场所，室内温度18 ℃～25 ℃，封闭性良好，避免阳关直 射，提前清理好环境卫生，对操作台用75%酒精进行消毒。 7.2 操作人员卫生安全 清洗双手并用75%酒精消毒，佩戴一次性口罩和手套，穿着消毒后的工作服，进行胚胎冷冻、解冻 操作。 7.3 冷冻、解冻前胚胎预备 7.3.1 将采集到的牦牛胚胎及时送至操作室，置于恒温平台上，按照本规程 8 规定的方法在体视显微 镜下进行胚胎分拣和分类。 7.3.2 冷冻胚胎解冻时，将装有冷冻胚胎的液氮罐置于操作室内，按照本规程 10 规定的方法操作。 8 冷冻前胚胎分级 8.1 按照 GB/T 25881 对牦牛胚胎分级评定、筛选。 8.2 A 级、B 级和 C 级胚胎均为可用胚胎，D 级为不可用胚胎。A 级、B 级适于移植或冷冻保存；C 级仅 适用于鲜胚移植。 9 胚胎快速冷冻 9.1 将装有基础液（BS）、平衡液（ES）、快速冷冻液（VS）的离心管从冷藏箱内取出，置于 25℃ 温水中水浴 20 min。 9.2 将适量液氮倒入泡沫箱中。 9.3 在胚胎快速冷冻管和冷冻管包装袋（桶）上标注胚胎来源、品种、生产批号、胚胎数量、胚胎发 育期、胚胎级别、存入时间等。 9.4 取出直径 35 mm 的一次性培养皿 3 个，在外底部分别标注 BS、ES、VS，用移液器加入相应的液体 各 3 mL。 9.5 在配有显微镜恒温板的体视显微镜下，将分类、分检后的 A 级、B 级胚胎放入 BS 液中，通过在 BS 液内移动位置 3 次，然后静置 2 min～3 min 的方式进行清洗。 3 DB63/T 1709—2018 9.6 将清洗后的胚胎移入 ES 液中，并在平衡液中移位 2 次后，放置平衡 3 min。 9.7 将平衡后的胚胎移入 VS 液中 15 s～20 s 后，在 40 s 内将胚胎移至胚胎快速冷冻管（Cryotop） 管片上，迅速浸入泡沫箱中的液氮中。 9.8 在泡沫箱的液氮中用镊子将胚胎快速冷冻管管片端插入套管后，放入冷冻管保存袋（桶）中，将 冷冻管保存袋（桶）置于符合 GB/T 5458 规定的液氮罐中保存。 10 胚胎解冻 10.1 将胚胎解冻液（TS）、稀释液（DS）、基础液（BS）和胚胎移植液（TM）从冷藏箱内取出，置于 38℃温水中水浴 20 min。 10.2 在 35 mm 无菌培养皿外底部分别标注 TS、DS、BS 和 TM，每种液体在使用前 1 min 内，用移液器 在培养皿中各注入 3 mL 相应的液体，用于胚胎解冻、清洗、移植等。 10.3 将快速冷冻管 Cryotop 从液氮罐中取出，放入泡沫箱内的液氮中，取掉冷冻管套管，迅速将存放 有胚胎的一端浸入 TS 中，静置解冻 1 min。 10.4 在显微镜下将解冻后的胚胎检出后移入 DS 中静置 5 min，然后移入 BS 中移动清洗 3 次。 10.5 将清洗后的胚胎移入 TM 液中，按照移植液、空气、移植液+胚胎、空气、移植液分段装入 0.25 mL 胚胎细管中，用聚乙烯醇（PVA）细管封口粉封闭前端管口，按照 NY/T 1572 相关规程进行胚胎移植。 10.6 如操作室有二氧化碳培养箱，需进行解冻后的胚胎培养筛选时，解冻操作前在 35 mm 培养皿中制 作覆盖有石蜡油的 100 μL 胚胎培养液微滴，置于 5% CO2、38.5℃、饱和湿度的培养箱中平衡 2 h。将 清洗后的胚胎移入胚胎培养液微滴中，在培养箱内培养 2 h 后，检查筛选出活力良好的胚胎，放入胚胎 移植液中，按照本规程 10.5 的规定装入 0.25 mL 胚胎细管，用于移植。 _________________________________ 4