ICS 11.020 C 04 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 394.1—2017 代替 DB 22/T 394-2004 保健用品微生物检验方法 第 1 部分：菌落总数测定 Microbiological examine method for health care material Part 1:Aerobic bacterial count 2017 - 11 - 10 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 12 - 30 实施 发 布 DB22/T 394.1—2017 前 言 DB22/T 394《保健用品微生物检测方法》拟分为如下部分： ——第1部分：菌落总数测定； ——第2部分：耐热大肠菌群测定； ——第3部分：铜绿假单胞菌测定； ——第4部分：金黄色葡萄球菌测定； ——第5部分：霉菌和酵母菌数测定。 本部分为DB22/T 394-2017的第1部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本部分代替DB22/T 394-2004《保健用品微生物检验方法》，与DB22/T 394-2004相比，结构做了较 大调整。除编辑性修改外，主要技术内容变化如下： ——删除了乙型溶血性链球菌； ——删除了定量杀菌试验。 本部分由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。 本部分起草单位：吉林省疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：杨修军、刘桂华、黄鑫、赵薇、张立夫。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： ——DB22/T 394-2004。 I DB22/T 394.1—2017 保健用品微生物检验方法 第 1 部分：菌落总数测定 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了保健用品中微生物中菌落总数的测定方法。 本标准适用于生产和经营的保健用品中菌落总数的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 菌落总数 aerobic bacterial count 食品检样经过处理,在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间等)培养后,所得每 g(mL)检样中 形成的微生物菌落总数。 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 5 5.1 5.2 5.3 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯 。实验用水符合 GB/T 6682 中二级水的要求。 灭菌生理盐水:见附录 A.1。 灭菌液体石蜡:见附录 A.2。 灭菌吐温-80:见附录 A.3。 营养琼脂培养基:见附录 A.4。 0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）:见附录 A.5。 仪器和设备 天平。 灭菌刻度吸管:10 mL、5 mL、1 mL。 高压锅。 1 DB22/T 394.1—2017 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 6 量筒。 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:44.5 ℃±0.5 ℃。 三角烧瓶。 研钵。 振荡器。 灭菌平皿:直径 90 mm。 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。 放大镜。 样品 6.1 样品的采集 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批保健用品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检 验时，应从不少于2个包装单位的取样中共取10 g（5.1）或10 mL（5.2）。包装量小于20 g的样品，采 样时可适量增加样品包装数量。 6.2 注意事项 6.2.1 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被 污染。 6.2.2 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应 放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。 6.2.3 若只有一个样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做微生 物检验，再将剩余样品做其它分析。 6.2.4 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿 及材料均应事先灭菌（5.3），全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。 6.3 样品的制备 6.3.1 液体样品 水溶性液体样品，用灭菌吸管吸取10 mL加到90 mL（5.4）灭菌生理盐水（4.1）中，混匀后，制成 1:10匀液。 油性液体样品，取样品10 g，先加5 mL灭菌液体石蜡（4.2）混匀，再加10 mL灭菌的吐温-80，在 40 ℃～44 ℃水浴中（5.5）振荡混合10 min，加入灭菌的生理盐水75 mL（在40 ℃～44 ℃水浴中预温）， 在40 ℃～44 ℃水浴中乳化，制成1:10的悬液。 6.3.2 膏、霜、乳剂半固体状样品 亲水性的样品，称取10 g，加到装有玻璃珠及90 mL灭菌生理盐水的三角烧瓶（5.6）中，充分振荡 混匀，静置15 min，用其上清液作为1:10的匀液。 疏水性样品，称取10 g，放到灭菌的研钵（5.7）中，加10 mL灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状再加入 10 mL灭菌吐温-80，研磨待溶解后，加70 mL灭菌生理盐水，在40 ℃～44 ℃水浴中充分混合，制成 1:10 匀液。 6.3.3 2 固体样品 DB22/T 394.1—2017 称取10 g，加到90 mL灭菌生理盐水中，充分振荡（5.8）混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液 作为1:10的匀液。 6.3.4 膜状样品 2 2 取10 cm ，将膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中，加100 mL生理盐水，使成10 mL/cm 浓度，浸泡10 min 到15 min，摇匀即得。 6.3.5 含抑菌成分检验样品的制备 6.3.5.1 稀释法:用稀释液和培养基将样品稀释到一定浓度，使其抑菌成分的浓度减少到无菌作用的浓 度，再进行检验。 6.3.5.2 中和法:在检验样品或培养基中加入吐温-80 和卵磷脂作为中和剂，以中和其抑菌效果。 6.3.5.3 对吸水膨胀或粘度大的样品，可制成 1:20 样液。 7 试验步骤 7.1 培养 用灭菌吸管吸取1:10 稀释的匀液 2 mL，分别注入到两个灭菌平皿（5.9）内，每皿1 mL。另取1 mL 注入到9 mL灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成1:100 匀液。吸取2 mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1 mL。如样品含菌量高，还可再稀释成1:1000， l:10000，……等，每种稀释度应换1 支吸管。 将融化并冷至45 ℃～50 ℃的营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15 mL，随即转动平皿，使样 品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36 ℃±1 ℃培养箱（5.10）内培养48 h±2 h。 另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15 mL营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36 ℃± 1 ℃培养箱内培养48 h±2 h，为空白对照。 如保健用品中的颗粒与菌落不易区分，可在每100 mL营养琼脂中加入1 mL 0.5%的TTC溶液，如有细 菌存在，培养后菌落呈红色，而保健用品的颗粒颜色无变化。 7.2 菌落计数 先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5 倍～10 倍的放大镜（5.11）检查，以防遗漏。记下 各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌 落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀， 则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。 8 试验数据处理 8.1 选取平均菌落数在 30 个～300 个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平 均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数报告之（见表 1 中例 1）。 8.2 若有两个稀释度，其平均菌落数均在 30 个～300 个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若 其比值小于或等于 2，应报告其平均数，若大于 2 则以其中稀释度较低的平皿的菌落数报告之（见表 1 中例 2 及例 3）。 8.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于 300 个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之 （见表 1 中例 4）。 3 DB22/T 394.1—2017 8.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于 30 个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之 （见表 1 例 5）。 8.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在 30 个～300 个之间，其中一个稀释度大于 300 个，而相邻的另 一稀释度小于 30 个时，则以接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表 1 中例 6）。 8.6 若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每 g 或每 mL 小于 10 CFU。 8.7 菌落计数的报告，菌落数在 10 以内时，按实有数值报告之，大于 100 时，采用二位有效数字，在 二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用 10 的指数来表示 （见表 1 报告方式栏）。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。 表1 例次 细菌计数结果及报告方式 不同稀释度平均菌落数 10 ～1 10 -2 164 10 -3 菌落总数 报告方式 菌数之比 CFU/mL或CFU/g CFU/mL或CFU/g － 16400 1.6 38000 1 1356 2 2760 3 2890 271 60 2.2 27100 4 不可计 4650 513 － 513000 5 27 11 5 － 270 6 不可计 305 12 － 30500 7 0 － ＜1×10 259 0 20 两稀释度 46 0 注：CFU:菌落形成单位。 8.8 9 按重量取样的样品以 CFU/g 为单位报告；按体积取样的样品以 CFU/mL 为单位报告。 防止污染措施 应按照GB 19489的规定执行。 4 16000或 1.6×104 38000或 3.8×104 27000或 2.7×104 51000或 5.1×105 270或2.7×102 31000或 3.1×104 ＜10 DB22/T 394.1—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂