DB13/T 2595—2017 ICS 65.020 B 16 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB13/T 2595—2017 葡萄霜霉病菌保存技术规程 2017 - 11 - 22 发布 河北省质量技术监督局 2017 - 12 - 22 实施 发 布 DB13/T 2595—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北农业大学提出。 本标准起草单位：河北农业大学、辽宁省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：冉隆贤、申红妙、李正楠、贾招闪、甄志先、刘长远、杜兴兰。 Ⅰ DB13/T 2595—2017 葡萄霜霉病菌保存技术规程 1 范围 本标准规定了葡萄霜霉病菌[Plasmopara viticola (Berk et Curtis) Berl. et de Toni]离体保 存技术的术语和定义、葡萄霜霉病菌保存概述和葡萄霜霉病菌保存技术等内容。 本标准适用于教育、研究机构、农药研发部门和药效测定单位等保存葡萄霜霉病菌。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 葡萄试管苗 In vitro Grape Plantlet 是指在试管等容器中经过组织培养获得的葡萄苗。 2.2 水琼脂平板 Water Agar Plate 用作保湿的平板培养基。6 g琼脂，1000 mL蒸馏水，直径9 cm的培养皿每个约倒入10 mL。 3 葡萄霜霉病菌保存概述 葡萄霜霉病菌只能在活体寄主上存活，在离体培养基上不能生长繁殖和保存，致使相关的研究受 到限制。要保持对该病菌持续的研究并排除其它杂菌的干扰，需对葡萄霜霉病菌进行保存，且保持病 菌的致病力，并提高其存活率和稳定性。本规程针对不同的用途，分别对葡萄霜霉病菌进行了超低温 保存，主要用于病菌的长期保存；真空冷冻干燥保存，主要用于病菌复壮；葡萄试管苗叶片保存，主 要用于病菌纯化，以保证病菌生物学和遗传学等研究结果的准确性。 4 葡萄霜霉菌保存技术 4.1 超低温保存法 4.1.1 葡萄霜霉病样采集 在田间采集感染葡萄霜霉病的新鲜发病叶片，装于保鲜袋中，并放置于0℃～4℃的保温盒中带回 室内。 4.1.2 霜霉病样的预处理 用清水冲洗叶片，用灭菌棉签轻刷叶片表面的霉层； 将蘸湿的脱脂棉球包住叶柄，背面朝上置于垫有湿纱布的培养皿中； 培养皿用保鲜膜封口，置入光照培养箱中（20℃、12 h光照，18℃、12 h黑暗，相对湿度100 %） 培养2 d，待其重新长出干净的霜霉层，备用。 1 DB13/T 2595—2017 4.1.3 孢子囊悬浮液的制备 用灭菌的棉签将新长出霉层上的孢子囊刷至无菌水中，用单层擦镜纸过滤，去除孢囊梗，得到干 净的孢子囊； 6 用无菌水调节浓度为10 个/mL的孢子囊悬浮液，备用。 4.1.4 孢子囊的保存 取4.1.3中获得的孢子囊悬浮液10 mL，加入等量的10%的二甲基亚砜（DMSO），配制成含5%二甲基 亚砜的孢子囊悬浮液。 将配好的孢子囊悬浮液分装于规格为2.0 mL的冻存管中，置于-80℃的超低温冰箱中保存。 待需要霜霉病菌时，取出冻存管，室温融化后，在2000 rpm下离心15 min，弃上清，加入无菌水 混匀并再次离心，用于清洗孢子囊，去除二甲基亚砜，共离心3次。用无菌水调节浓度后接种于干净健 康的葡萄叶片背面繁殖使用。 4.1.5 保存时效 含5 %二甲基亚砜的孢子囊悬浮液-80℃超低温可以保存至少5年，孢子囊的致病力无明显降低。 4.2 真空冷冻干燥保存法 4.2.1 霜霉病叶冷冻干燥 霜霉病样采集及预处理同4.1.1和4.1.2； 将4.1.2中准备好的新鲜病叶的病斑部位剪成2 cm×2 cm大小，放入冷冻干燥机中，在温度为-41℃、 压力为13.0Pa下真空冷冻干燥36 h，直至材料恒重。 4.2.2 真空封装 将真空冷冻干燥后的病叶碎片取出，分装进规格为20 cm×30 cm的铝箔袋，并用真空封口机进行 压缩封口处理，每袋30片； 将分装的材料分别置于4℃、-20℃或-80℃的冰箱中保存。 4.2.3 保存时效 4℃保存，孢子囊具有较高致病力，最适保存25 d～35 d； -20℃低温保存，对孢子囊致病力影响较小，最适保存1年； -80℃超低温保存，更有利于孢子囊保持较高致病力，适合长期保存。 4.3 葡萄试管苗叶片保存法 4.3.1 培养基的配制 4.3.1.1 水琼脂的配制 称取6 g琼脂粉加入蒸馏水中，并用玻璃棒搅拌，均匀加热使其完全溶解，定容至1000 mL； 取200 mL分装于500 mL的三角瓶中，置于高压灭菌锅内121℃下灭菌20 min～30 min； 将灭菌后的三角瓶取出，室温放置24 h，确定无杂菌生长后待用。 4.3.1.2 葡萄培养基的配制 以1/2 MS+1 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L IBA +30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂（pH值为5.8～6.0）进行配制； 2 DB13/T 2595—2017 将配制好的培养基倒入100 mL三角瓶内，每瓶40 mL，把分装培养基后的三角瓶置于高压灭菌锅内 121℃下灭菌20 min～30 min，待用。 4.3.2 葡萄枝条预处理与消毒 取未木质化或半木质化的新鲜葡萄枝条，去除叶片，剪成3 cm～4 cm长的带腋芽的小段，用流水 冲洗5 min； 在超净工作台上，将洗净的茎段用70 %的酒精浸泡30 s，再用0.1%升汞浸泡 5 min～10 min，最 后用无菌水清洗4次； 将消毒后的茎段放在无菌滤纸的培养皿中，剪去茎段上下两端褐化的部分，形态学上端平剪，下 端剪为马蹄形； 将剪成2 cm～2.5 cm的带腋芽茎段接入灭菌好的培养基中，置于培养室内培养（25℃、12 h光照， 20℃、12 h黑暗）。 4.3.3 葡萄试管苗叶片接种 待葡萄试管苗高度达到5 cm以上，着生3～5片叶时，在超净工作台上，用灭菌后的剪刀剪取试管 苗叶片，将剪下的叶片背面朝上放置于倒好的水琼脂平板上； 取4.1.2中重新长出干净霜霉层的叶片，用蘸有无菌水的挑针轻轻挑取干净的霜霉病菌，将其接种 于试管苗叶片上； 接种后将平板密封，置于光照培养箱内培养7 d～10 d，培养条件同4.1.2。 4.3.4 霜霉菌的纯化 按照4.3.3的方法取出试管苗叶片，背面朝上放置于水琼脂平板上，用蘸有无菌水的解剖针挑取已 接种试管苗叶片上的霜状霉层接菌，培养条件同4.1.2，以获得没有杂菌的葡萄霜霉病菌。 4.3.5 保存时效 在缺乏寄主的季节和地区，可利用葡萄试管苗叶片在室内对葡萄霜霉病菌进行连续培养和扩繁， 4℃可以保存30 d～35 d，20℃可以保存10 d～12 d。 _________________________________ 3