ICS 11.020 C 04 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 394.2—2017 代替 DB 22/T 394-2004 保健用品微生物检验方法 第 2 部分：耐热大肠菌群测定 Microbiological examine method for health care material Part 2:Determination of thermotolerant coliform bacteria 2017 - 11 - 10 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 12 - 30 实施 发 布 DB22/T 394.2—2017 前 言 DB22/T 394《保健用品微生物检测方法》拟分为如下部分： ——第1部分：菌落总数测定； ——第2部分：耐热大肠菌群测定； ——第3部分：铜绿假单胞菌测定； ——第4部分：金黄色葡萄球菌测定； ——第5部分：霉菌和酵母菌数测定； 本部分为DB22/T 394-2017的第2部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本部分代替DB22/T 394-2004《保健用品微生物检验方法》，与DB22/T 394-2004相比，结构做了较 大调整。除编辑性修改外，主要技术内容变化如下： ——将粪大肠菌群修正为耐热大肠菌群； ——将培养时间由 44.0 ℃ 修正为 44.5 ℃； ——删除了乙型溶血性链球菌； ——删除了定量杀菌试验。 本部分由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。 本部分起草单位：吉林省疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：杨修军、黄鑫、刘桂华、赵薇、张立夫。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： ——DB22/T 394-2004。 I DB22/T 394.2—2017 保健用品微生物检验方法 第 2 部分：耐热大肠菌群测定 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了保健用品中微生物中耐热大肠菌群的测定方法。 本标准适用于生产和经营的保健用品中耐热大肠菌群的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 耐热大肠菌群 thermotolerant coliform bacteria 系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5 ℃培养24 h至48 h能发酵乳糖产酸并产气。 该菌主要来自人和温血动物粪便，可作为粪便污染指标来评价保健用品的卫生质量, 推断保健用品 中有否污染肠道致病菌的可能。 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯 。实验用水符合 GB/T 6682 中二级水的要求。 灭菌生理盐水:详见附录 A.1。 灭菌液体石蜡:详见附录 A.2。 灭菌吐温-80:详见附录 A.3。 乳糖胆盐发酵培养基:详见附录 A.4。 伊红美兰琼脂:详见附录 A.5。 蛋白胨水:详见附录 A.6。 革兰氏染液:详见附录 A.7。 靛基质:详见附录 A.8。 仪器和设备 1 DB22/T 394.2—2017 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 6 天平：感量 0.1 g。 灭菌刻度吸管:10 mL、5 mL、1 mL。 高压灭菌器。 量筒：100 mL、200 mL、2000 mL。 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:44.5 ℃±0.5 ℃。 无菌锥形瓶：100 mL、200 mL、250 mL、2000 mL。 研钵。 振荡器。 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃、44 ℃±0.5 ℃。 接种针、接种环。 滴管。 显微镜。 样品 6.1 样品的采集 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批保健用品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检 验时，应从不少于2个包装单位的取样中共取10 g(5.1)或10 mL(5.2)。包装量小于20 g的样品，采样时 可适量增加样品包装数量。 6.2 注意事项 6.2.1 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被 污染。 6.2.2 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应 放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。 6.2.3 若只有一个样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做微生 物检验，再将剩余样品做其它分析。 6.2.4 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿 及材料均应事先灭菌(5.3)，全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。 6.2.5 如检出铜绿假单胞菌，自报告发出之日起该菌种应保存一个月。 6.3 样品的制备 6.3.1 液体样品 水溶性液体样品，用灭菌吸管吸取10 mL加到90 mL（5.4）灭菌生理盐水（4.1）中，混匀后，制成 1:10匀液。 油性液体样品，取样品10 g，先加5 mL灭菌液体石蜡（4.2）混匀，再加 10 mL 灭菌的吐温-80， 在40 ℃～44 ℃水浴中（5.5）振荡混合10 min，加入灭菌的生理盐水75 mL（在40 ℃～44 ℃水浴中预 温），在40 ℃～44 ℃水浴中乳化，制成1:10的悬液。 6.3.2 膏、霜、乳剂半固体状样品 亲水性的样品，称取10 g，加到装有玻璃珠及90 mL 灭菌生理盐水的三角烧瓶（5.6）中，充分振 荡混匀，静置15 min，用其上清液作为1:10的匀液。 2 DB22/T 394.2—2017 疏水性样品，称取10 g，放到灭菌的研钵（5.7）中，加10 mL 灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状再加 入10 mL灭菌吐温-80，研磨待溶解后，加70 mL 灭菌生理盐水，在40 ℃～44 ℃水浴中充分混合，制成 1:10匀液。 6.3.3 固体样品 称取10 g，加到90 mL 灭菌生理盐水中，充分振荡（5.8）混匀，使其分散混悬，静置后，取上清 液作为1:10的匀液。 6.3.4 膜状样品 2 2 取10 cm ，将膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中，加100 mL生理盐水，使成10 mL/cm 浓度，浸泡10 min 到15 min，摇匀即得。 6.3.5 含抑菌成分检验样品的制备 6.3.5.1 稀释法:用稀释液和培养基将样品稀释到一定浓度，使其抑菌成分的浓度减少到无菌作用的浓 度，再进行检验。 6.3.5.2 中和法:在检验样品或培养基中加入吐温-80 和卵磷脂作为中和剂，以中和其抑菌效果。 6.3.5.3 对吸水膨胀或粘度大的样品，可制成 1:20 样液。 7 试验步骤 7.1 培养 取10 mL 1:10 稀释的匀液，加到10 mL双倍浓度的乳糖胆盐培养基(4.4)中，置44.5 ℃±0.5 ℃培 养箱(5.9)中培养24 h，如既不产酸也不产气，继续培养至48 h，如仍既不产酸也不产气，则报告为耐 热大肠菌群阴性。 如产酸产气，划线(5.10)接种到伊红美蓝琼脂平板(4.5)上，置36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。同时 取该培养液1 滴～2 滴(5.11)接种到蛋白胨水(4.6)中，置44.5 ℃±0.5 ℃培养24 h±2 h。 经培养后,在上述平板上观察有无典型菌落生长。耐热大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌 落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属 光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为耐热大肠菌群，应注意挑选。 7.2 镜检 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色(4.7)镜检（5.12）。 7.3 生化反应 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质(4.8)试剂约0.5 mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色； 阴性反应液面呈试剂本色。 8 试验数据处理 根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则 可报告被检样品中检出耐热大肠菌群。 3 DB22/T 394.2—2017 9 防止污染措施 应按照GB 19489的规定执行。 4 DB22/T 394.2—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂或材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 A.1 生理盐水: A.1.1 成分 氯化钠 蒸馏水 A.1.2 8.5 g 1000 mL 制法 溶解后，分装10 mL管后，121 ℃高压灭菌20 min。 A.2 灭菌液体石蜡 取液体石蜡50 mL，121 ℃高压灭菌20 min。 A.3 灭菌吐温-80 取吐温-80 50 mL，121 ℃高压灭菌20 min。 A.4 乳糖胆盐培养基 A.4.1 成分 蛋白胨 猪胆盐 乳糖 0.4%溴甲酚紫水溶液 蒸馏水 A.4.2 20 g 5 g 5 g 2.5 mL 1000 mL 制法 将蛋白胨、胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，调pH至7.4，加入指示剂，混匀，分装试管（每支试管中 加一个小倒管）。115 ℃高压灭菌20 min。双倍浓度乳糖胆盐培养基按上述乳糖胆盐培养基成分，蒸馏 水量不变，其它成分量加倍。 A.5 A.5.1 伊红美兰(EMB)琼脂 成分: 5 DB22/T 394.2—2017 蛋白胨 乳糖 磷酸氢二钾 琼脂 2%伊红水溶液 0.5%美蓝水溶液 蒸馏水 A.5.2 10 g 10 g 2 g 20 g 20 mL 13 mL 1000 mL 制法 先将琼脂加到900 mL 蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨，混匀，使之溶解。再 以蒸馏水补足至1000 mL。校正pH为7.2～7.4，分装于三角瓶内，121 ℃高压灭菌15 min 备用。临用时 加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60 ℃左右无菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。 A.6 蛋白胨水（作靛基质试验用） A.6.1 成分 蛋白胨（或胰蛋白胨） 氯化钠 蒸馏水 A.6.2 20 g 5 g 1000 mL 制法 将上述成分加热融化，调pH为7.0～7.2，分装小试管，121 ℃高压灭菌15 min 。 A.7 革兰氏染色液