ICS 65.020.01 B 07 DB41 河 南 省 地 方 标 准 DB 41/T 1562—2018 金银花指纹图谱检测规程 2018 - 03 - 14 发布 河南省质量技术监督局 发 布 2018 - 06 - 14 实施 DB41/T 1562—2018 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由河南省中医管理局提出并归口。 本标准主要起草单位：河南省中医药研究院、河南省标准化研究院、河南省封丘县农村科技开发中 心。 本标准主要起草人：刘长河、王艳艳、李华妮、赵国敏、许书军、葛文静、郭国安。 本标准参加起草人：党洁、徐钰佳、任孝德、刘方洲、李开言。 I DB41/T 1562—2018 金银花指纹图谱检测规程 1 范围 本标准规定了金银花指纹图谱检测的术语和定义、原理、试剂与试药、仪器设备、检测方法、判定 等。 本标准适用于河南产金银花的高效液相色谱法指纹图谱检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 金银花指纹图谱 金银花经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示金银花特性的共有峰的图谱。 2.2 相似度 供试品图谱与对照指纹图谱相似的程度。 2.3 特征色谱峰 色谱中具有一定特征的色谱峰。 3 原理 样品经过50%甲醇提取，利用乙腈，磷酸、醋酸混合酸溶液梯度洗脱，以高效液相色谱法在240nm 波 长下测定样品溶液的指纹图谱，根据样品与金银花的对照标准图谱的相似度进行比较，参照中药指纹图 谱相似度评价软件计算样品的相似度（国家药典委员会），根据相似度评价金银花的真伪、优劣。 4 试剂与试药 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2 磷酸：分析纯。 4.3 醋酸：分析纯。 4.4 甲醇：分析纯。 4.5 0.03%磷酸、0.3%醋酸溶液：吸取磷酸 0.3 mL、醋酸 3 mL 至加有 900 mL 水的量瓶中，用水定容 至 1000 mL。 4.6 水：GB/T 6682 规定的实验用一级水。 4.7 标准品：绿原酸（CAS NO327-97-9，纯度≥98%）；木犀草苷（CAS NO5373-11-5，纯度≥98%）。 4.8 参照物溶液：精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每 1mL 含 0.05 mg 的溶液。 1 DB41/T 1562—2018 4.9 混合对照品溶液：精密取绿原酸、木犀草苷对照品，加甲醇制成每 1mL 分别含绿原酸 0.05mg、木 犀草苷 0.01 mg 的混合溶液，作为对照品溶液。 4.10 金银花（Lonicera japonica Thunb.） 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 高效液相色谱仪（紫外检测器）。 色谱柱（十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；4.6 mm×250 mm 5 µm 或相当者）。 电子分析天平（十万分之一）。 数控超声波清洗器（功率 250 W，频率 50 kHz）。 6 检测方法 6.1 参照物及对照品溶液的制备 称取绿原酸对照品，加甲醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液作为参照物溶液，在10℃以下保存；再取 绿原酸、木犀草苷对照品，加甲醇制成每1 mL分别含绿原酸0.05 mg、木犀草苷0.01 mg的混合溶液，作 为对照品溶液。 6.2 供试品溶液的制备 取金银花粉末（60目）0.5 g(千分之一)，称定重量，置具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇溶液100 mL， 称定重量，超声处理30 min，称重，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45 µm 微孔滤膜滤过，即得。 6.3 测定 6.3.1 色谱条件 ——色谱柱：色谱柱（十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；4.6 mm×250 mm 5µm 或相当者）。 ——流动相：乙腈（A）-0.03%磷酸、0.3%醋酸溶液（B），梯度洗脱（0 min～10 min，6%A，0.9 mL. min-1；10 min～35 min，6%～18%A，0.9 mL.min～0.5mL. min-1；35 min～36 min， 18%A， 0.5 mL. min-1；36 min～70 min，18%～32%A，0.5 mL. min-1）。 ——柱温：40 ℃。 ——进样量：10 µL。 ——指纹图谱检测波长：240 nm。 6.3.2 指纹图谱测定 分别精密吸取绿原酸参照物溶液、金银花样品溶液，按6.3.1色谱条件检测，记录0 min～60 min 的色谱图。对金银花的色谱峰进行积分，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版建立参照物绿原酸以 及金银花对照模板，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统B版（国家药典委员会）计算各样品的相似度。 7 判定 7.1 在相同实验条件下，将样品指纹图谱与绿原酸参照物图谱、对照品图谱及金银花对照指纹图谱进 行比较，典型的对照指纹图谱见附录 A。 2 DB41/T 1562—2018 7.2 金银花等级判定见表 1。 表1 等级 金银花等级判定 性状 指纹图谱 花蕾呈棒状，上粗下细、略弯曲。表面绿白 色，花冠厚，质稍硬，握之有顶手感。气清 一等 香，味甘微苦。无开放花朵，破裂花蕾及黄 条不超过 5%（w/w）。无黑条、黑头、枝叶、 相似度不小于90%；显绿原 酸、木犀草苷峰。 杂质、虫蛀、霉变。 开放花朵不超过 5%（w/w），破裂花蕾及黄条 二等 不超过 10%（w/w），无黑条、枝叶。其他标 准同一等。 三等 四等 等外 相似度不小于 90%；显绿原 酸、木犀草苷峰。 开放花朵、黑条不超过 30%（w/w），无枝叶。 相似度大于或等于80%小于 其他标准同一等。 90%；显绿原酸、木犀草苷峰。 花蕾和开放花朵兼有，色泽不分。枝叶不超 相似度大于或等于60%小于 过 3%（w/w）。无杂质、虫蛀、霉变。 80% 花蕾和开放花朵兼有，色泽黑暗。枝叶超过 3%（w/w）。无杂质、虫蛀霉变。 相似度小于60% 7.3 共有指纹峰的标定 根据指纹图谱技术要求，以药材相对保留时间均值标定共有指纹峰，与参照物绿原酸保留时间相对 应的峰为S峰，计算特征色谱峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内。规定值 为： 0.88（峰1）、1.00 (峰S)、1.07（峰2）、1.18 (峰3) 、1.27 (峰4)、1.62 (峰5)、1.98 (峰6)、 2.12 (峰7) 、2.25 (峰8)、2.30 (峰9)、2.35 (峰10) 、2.40（峰11）、2.44（峰12）、2.54 (峰13)、 2.60 (峰14)、2.63 (峰15)、2.69(峰16)、 2.93 (峰17)、2.98 (峰18)、3.15 (峰19)。 7.4 共有指纹峰面积的比值 以药材峰面积的比值确定共有指纹峰面积的比值。与参照物绿原酸保留时间相对应的峰为S峰，计 算特征色谱峰峰面积与S峰峰面积的相对峰面积。部分批次的第16个峰的峰面积占总峰面积在10%～20%； 部分在20%以上，根据指纹图谱技术要求，峰面积差值范围为：（4）：（6）：（7）：（16）：S =(0.403～ 1.011) ：（0.117～0.569)：（0.222～1.319）：（0.655～1.432)：（1.000）。 3 DB41/T 1562—2018 AA 附 录 A （规范性附录） 典型对照图谱 A.1 金银花对照指纹图谱见图A.1。 图 A.1 金银花对照指纹图谱 A.2 参照物（绿原酸）图谱见图A.2。 图 A.2 参照物（绿原酸）图谱 4 DB41/T 1562—2018 A.3 绿原酸、木犀草苷对照品图谱见图A.3。 图 A.3 绿原酸、木犀草苷对照品图谱 A.4 等外品金银花对照指纹图谱见图A.4。 图 A.4 等外品金银花对照指纹图谱 注 1：相似度评价软件 A 版、B 版：国家药典委员会（http://www.chp.org.cn/index.html）。 注 2：典型对照图谱电子数据：河南省中医药研究院（http://www.hntcm.com“资料下载”）。 _________________________________ 5