ICS 65.020.30 B 43 备案号：35830-2013 青 海 DB63 省 地 方 标 准 DB 63/T 1163—2012 牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程 2012 - 12 - 04 发布 青海省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB63/T 1163—2012 前 言 本规程依据GB/T 1.1—2009的规则编写。 本规程由青海省畜牧兽医科学院提出并归口。 本规程起草单位：青海省畜牧兽医科学院畜牧研究所。 本规程主要起草人：徐惊涛、孙永刚、才让东智、马志杰。 I DB63/T 1163—2012 牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程 1 范围 本规程规定了牦牛体外受精胚胎生产的术语和定义、牦牛卵母细胞分级、体外成熟、体外受精及受 精卵体外培养的方法和牦牛胚胎分级。 本规程适用于牦牛体外受精胚胎生产技术推广应用的规范化操作。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4143 牛冷冻精液 GB/T 25881 牛胚胎 NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本规程。 3.1 卵母细胞体外成熟 In vitro maturation，IVM 指从活体或离体牦牛卵巢的卵泡中采集未成熟的卵母细胞，在体外进行培养，使之恢复减数分裂到 MII期并具备受精能力的发育过程。 3.2 体外受精 In vitro fertilization，IVF 通过人为操作使哺乳动物的精子和卵子在体外环境中完成受精过程的技术。 3.3 体外胚胎生产技术 In vitro embryo production，IVEP 通过采集牦牛卵母细胞，将之经过体外成熟培养 (In vitro maturation，IVM)后与获能的精子进 行体外受精 (In vitro fertilization，IVF)，再经过受精卵的体外培养(In vitro culture，IVC)等 一系列过程，在体外生产出可用于移植胚胎的技术。 4 4.1 试剂、耗材、设备和实验室要求 试剂 1 DB63/T 1163—2012 所用的试剂、药品以及要求见附录A。 4.2 耗材 所用耗材见附录A。 4.3 设备 所用主要设备见附录A。 4.4 实验室要求 工作区由准备室、缓冲间、无菌间、细胞保存室组成。其中，缓冲间面积不小于3平方米，并设有 更衣柜和紫外灯。紫外灯管距地面不应超过2.5米，每平方厘米有0.06微瓦能量的照射，每次照射时间 为20分钟~30分钟。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级。各种器具的清洗、消毒见附录B。 5 5.1 卵母细胞采集 活体采卵 借助超声波探测仪直接从活体牦牛的卵巢中吸取卵母细胞。其方法是：直肠把握卵巢，用超声波显 像仪和7.5/5.0 兆赫兹阴道扇形探头观察卵巢形态和卵泡位置，使卵泡位于采卵器的进针线上，然后开 启真空泵并推进19号采卵针（长60厘米）对卵泡进行穿刺，将含有卵母细胞的卵泡液抽入集卵杯。采卵 液的配置见附录C。 5.2 屠宰后的牦牛卵母细胞的采集 牦牛屠宰后30分钟内从体内摘取卵巢，置于25℃~35℃含青霉素（100单位/毫升）和链霉素（100 微克/毫升）的生理盐水中，2小时内运回实验室，在无菌条件下洗涤卵巢、去除其周围结缔组织后，用 消毒后的纱布或木质纤维纸巾沾干上面的生理盐水并包裹后，使用带18号针头的10毫升一次性注射器从 卵巢内部抽取表面直径2毫米~6毫米卵泡。 5.3 牦牛卵母细胞筛选 将收集到的卵泡液转入直径100毫米培养皿中，在实体显微镜下检出卵丘-卵母细胞复合体 （Cumulus-oocyte complexes, COCs），并按如下方法进行分类， A、B级用于体外受精: ——A 级：卵丘细胞层完整而致密、卵母细胞大小正常，细胞质均匀，颜色较暗并充满透明带； ——B 级：卵丘细胞不够完整或较松散，层数较少，卵母细胞颜色稍浅； ——C 级：卵丘细胞少或膨大变性，卵母细胞颜色浅或裸卵。 6 6.1 牦牛卵母细胞体外成熟 卵母细胞成熟培养 在直径60毫米无菌培养皿中用卵母细胞成熟培养液制作10个体积为50微升培养滴，覆盖石蜡油后在 CO2培养箱平衡2小时。将收集的A级和B级COCs在成熟培养液清洗3遍后，每15个COCs转入50微升成熟培 养微滴中，置入39℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中成熟培养24小时。卵母细胞成熟培养液的配制见附录C。 6.2 卵母细胞成熟的判定 2 DB63/T 1163—2012 显微镜下观察培养24小时的牦牛卵母细胞，卵丘细胞膨大扩散，卵母细胞质均匀、没有空泡，用0.1% 透明质酸酶除去卵丘细胞后能见到第一极体（Pb1）为已成熟，否则为未成熟卵母细胞。 7 7.1 牦牛卵母细胞体外受精 受精微滴制作 在直径35毫米的培养皿中制备50 微升IVF 微滴，覆盖石蜡油；提前2小时放入39℃、5%CO2 饱和湿 度的培养箱中平衡备用。受精液的配制见附录C。 7.2 冷冻精液的清洗分离 冷冻精液品质鉴定依据GB 4143。细管冷冻精液在37℃温水解冻40秒后，转入Percoll梯度分离液 (45%/90%) 中1500转/分钟离心20分钟，弃掉上清液后加入BO工作液（BO working solution）1000转/ 6 分钟离心5分钟，弃去上清液后用血球计数板计算精子数，然后使用BO工作液调整精子浓度为10×10 个/ 毫升。BO工作液的配制见附录C。 7.3 体外受精 每个受精微滴中加入50微升浓度调整后的精液，将成熟培养24小时的牦牛卵母细胞，用BO工作液清 洗两遍后每15个一组移入IVF微滴中，在39℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中受精培养18小时~20小时。 8 受精卵培养 受精结束后，将受精卵移入含有200微升培养液的1.5毫升离心管中，在震荡器上震荡40秒去除颗粒 细胞，受精卵用胚胎培养液洗涤3次，每20个受精卵移入已平衡2小时以上、覆盖石蜡油的50微升受精卵 培养微滴中或输卵管上皮细胞共培养微滴中培养，每隔48小时半量更换培养液。受精后48小时统计卵裂 率并吸弃未分裂的卵母细胞，继续培养至第6天-7天，定期观察早期胚胎发育情况。 9 9.1 胚胎的鉴定和分级 牦牛胚胎的鉴定 9.1.1 在 20 倍~40 倍体视显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度与 透明带的间隙以及变性情况等。胚胎的鉴定主要依据 GB/T 25881、NY/T 1674。 9.1.2 凡卵子的卵黄未形成分裂球以及细胞团的、均列为未受精卵。 9.1.3 胚胎的发育阶段： a）桑葚胚（morula）——可观察到球状的细胞团，细胞团占透明带内腔 50%~60%。 b）致密桑葚胚（compacted morula，CM）——卵裂球细胞进一步分裂变小，细胞团占透明带内腔 60%-70%。 c）早期囊胚（early blastocyst，EB）——内细胞团的一部分出现囊胚腔，但难以分清内细胞团和滋 养层，细胞团占透明带内腔 70%~80%。 d）囊胚（blastocyst，BL）——内细胞团和滋养层界限清晰，囊胚腔明显，细胞充满透明带内腔。 e）扩张囊胚（expanded blastocyst， EXB）——囊胚体积增大到原来的 1.2 倍~1.5 倍，透明带变薄。 f）孵化囊胚（hatched blastocyst，HB）——囊胚腔继续扩大，透明带破裂，细胞团脱出。 3 DB63/T 1163—2012 9.2 牦牛胚胎分级 9.2.1 根据体外胚胎的形态结构和发育能力，分为 A 级、B 级和 C 级三个等级。胚胎分级主要依据 GB/T 25881、NY/T 1674： ——A 级：胚胎结构形态完整，轮廓清晰，呈球形；分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适 中，无附着的细胞和液泡； ——B 级：轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到少量附着的细胞和液泡，变性细胞约占 10%~30%； ——C 级：轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞达 30%~50%。 9.2.2 胚胎的分级主要是便于移植。A 级、B 级和 C 级胚胎均为可用胚，但 A 级和 B 级胚胎可进行冷冻 保存，C 级胚胎只用于鲜胚移植。 4 DB63/T 1163—2012 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂、耗材和设备 A.1 主要试剂及要求 A.1.1 主要试剂 氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钙（CaCl2）、 二水氯化钙（CaCl2•2H2O）、二水磷酸二氢钾（NaH2PO4•2H2O）、六水氯化镁（MgCl2•6H2O）、碳酸氢钠（NaHCO3）、 酚红（Phenol Red）、葡萄糖、丙酮酸钠、青霉素、链霉素、促卵泡素（FSH）、雌二醇（E2）、胎牛 血清（FBS）、犊牛血清（CS）、牛血清白蛋白（BSA）、Theophylline、石蜡油。 A.1.2 试剂要求 所用的试剂为Sigma公司产品，均为细胞培养测试级或胚胎培养测试级，符合组织细胞培养要求。 A.2 主要耗材 A.2.1 A.2.2 A.2.3 A.2.4 A.2.5 A.2.6 A.2.7 A.3 培养皿：35毫米、60毫米、100毫米 注射器：1毫升、10毫升、20毫升、50毫升 滤器：0.22微米、0.45微米 离心管：0.5毫升、1.5毫升、10毫升、50毫升 0.25毫升塑料胚胎麦管 封口膜 胚胎吸管 主要设备 A.3.1 A.3.2 A.3.3 A.3.4 A.3.5 A.3.6 A.3.7 A.3.8 A.3.9 A.3.10 A.3.11 A.3.12 A.3.13 CO2培养箱 体视显微镜 胚胎冷冻仪 液氮生物容器 超纯水仪 恒温台 生物安全柜或超净工作台 电子天平（精确到0.1毫克） 高压灭菌器 离心机 超声波清洗仪 超声波显像仪 7.5/5.0兆赫兹阴道扇形探头 5 DB63/T 1163—2012 BB 附 录 B （规范性附录） 试验准备 B.1 器具洗涤 B.1.1 玻璃器皿清洗 B.1.1.1 浸泡 新购置的玻璃器皿使用前应先用自来水简单刷洗，然后用5%稀盐酸溶液浸泡12小时以上；其它培养 后的玻璃器皿在含有洗涤剂的清水中浸泡，不应留有气泡。 B.1.1.2 刷洗 浸泡后的玻璃器皿用软毛刷洗刷，洗刷时用力要轻，防刮底，防死角，反复洗刷后用清水冲洗