ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T35336—2017 苹果皱果类病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Apple fruit crinkle viroid 2017-12-29发布 2018-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35336—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：邓丛良、赵晓丽、吕玉峰、梁新苗、骆卫峰、郑春生、张永江。 GB/T35336-—2017 苹果皱果类病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了苹果皱果类病毒的检疫鉴定方法， 本标准适用于可能带有苹果皱果类病毒的植物材料的检测鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3苹果皱果类病毒基本信息 学名：Apple fruit crinkle viroid。 缩写：AFCVd。 分类地位：马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiviroidae）、苹果锈果类病毒属（Apscaviroid）。 苹果皱果类病毒的其他信息参见附录A。 4 方法原理 类病毒检测主要针对其核酸序列。主要的方法有RT-PCR和核酸分子杂交 5仪器设备、主要用具和主要试剂 5 5.1仪器设备 电子天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超 低温冰箱（一80℃）、制冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、PCR仪、微波炉、电泳仪、电 泳槽、凝胶分析成像系统、实时荧光PCR仪、杂交炉、塑料薄膜封口机、紫外交联仪、暗箱、摇床、恒温水 浴锅、组织破碎仪等。 5.2 2主要用具 可调移液器（2.5L、10μL、20uL、200μL、1000uL、5000uL）、无RNA酶吸头（10uL20uL 反应管（200uL）、实时荧光96孔反应板、杂交瓶、杂交膜、杂交袋、X光片。 5.3主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。RT-PCR检测试 剂见附录B；实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C；斑点杂交检测试剂见附录D。 1 GB/T353362017 6检测与鉴定 6.1 普通RT-PCR检测方法 普通RT-PCR检测方法见附录B。 6.2 实时荧光RT-PCR检测方法 实时荧光RT-PCR检测方法见附录C。 6.3 斑点杂交检测方法 斑点杂交检测方法见附录D。 7结果判定 样品经普通RT-PCR检测为阳性，且实时荧光RT-PCR检测为阳性或斑点杂交检测为阳性，则判 定为检出苹果皱果类病毒。 样品经普通RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知的AFCVd序列一致，则判定为检出苹果 皱果类病毒 样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知的AFCVd序列一致，则判定为检出 苹果皱果类病毒。 样品保存与结果记录 8 8.1 样品保存 样品经登记人和经手人签字后妥善保存3个月，种子保存在4℃冰箱内，生长苗木或插条保存在隔 6个月，以备复核、谈判和仲裁。保存期满后，应灭活处理。 8.2 结果记录 完整的实验记录要包括样品的来源、种类、采集时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人 员的签字，普通RT-PCR检测结果保存电泳照片，实时荧光RT-PCR检测结果保存荧光曲线图及Ct 值，斑点杂交检测保存照片，序列测定结果保存测序报告图。 2