ICS 67.050 CCS X 04 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2784—2022 食用向日葵品种鉴定 SNP 标记法 Varietal verification of the confection sunflower (Helianthus annuus L.) SNP marker technology 2022-08-30 发布 2022-09-30 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2784—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。 本文件起草单位：三瑞农业科技股份有限公司、华智生物技术有限公司、内蒙古自治区质量和标准 化研究院。 本文件主要起草人：JIUHUAN FENG(冯九焕)、常敏、唐顺学、陈海军、田冰川、涂伟伟、霍治军、 李乐、安燕珂、魏志恒、张耀、侯敏、张龙梅。 I DB15/T 2784—2022 食用向日葵品种鉴定 SNP 标记法 1 范围 本文件规定了利用单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记进行食用向 日葵（Helianthus annuus L.）品种鉴定的术语和定义、原理、仪器设备及耗材、试剂及溶液配制、检 测程序与方法、数据采集和记录、真实性验证、鉴定结果报告等要求。 本文件适用于食用向日葵的品种鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 GB 4407.2 经济作物种子 第2部分：油料类 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 品种鉴定 variety verification 判定及验证供检品种与对照品种是否为相同品种。 单核苷酸多态性 single nucleotide polymorphism（SNP） 基因组中基于单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。 竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应 kompetitive allele specific PCR（KASP） 通过引物末端特异性碱基竞争性匹配DNA模板实现SNP基因型分型的聚合酶链式反应。 推荐标记 recommended markers 能够最大程度地将供检品种与对照品种区分开来的优先选用的一组标记。 1 DB15/T 2784—2022 基因型分型 genotyping 通过检测方法确定某品种（或遗传材料）的基因、DNA区段或遗传标记的基因型。 4 原理 不同向日葵品种的基因组间存在核苷酸序列差异，其中单核苷酸（A、C、G、T）多态性(SNP)在基 因组内分布广泛、密度高，这种差异可以通过荧光标记的 KASP 基因型分型等技术进行检测。 利用一套多态性高、稳定性好、品种区别力强、具良好基因型分型质量的推荐标记，检测供检样 品与对照样品之间的 SNP 差异位点数目，从而判定及验证供检样品的品种真实性。 5 仪器设备及耗材 所需仪器设备及耗材为： ——实时荧光定量 PCR 仪、全自动样品快速研磨仪、高速离心机、核酸浓度测定仪、微孔板离心 机、微量移液器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、酸度计、磁力搅拌器、电子天平、冰箱等； ——微量离心管、普通枪头、384 孔 PCR 板（白色）、封板膜、钢珠等。 6 试剂及溶液配制 试剂要求 6.1.1 所用试剂至少为分析纯或分子生物学纯。试剂配制用水应符合 GB/T 6682 规定的一级水要求。 6.1.2 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA•2H2O）、三羟基甲基氨基甲烷（Trisbase）、三氯甲烷、异丙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、乙醇、PCR Master Mix 等。 溶液配制 6.2.1 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）：称取 186.1 g Na2EDTA•2H2O，溶于 800 mL 水中，加入固体 NaOH（约 20 g）调 pH 至 8.0，定容至 1000 mL，高压灭菌。 6.2.2 1.0 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)：称取 60.55 g Tris 碱，溶于 400 mL 水中，用 HCl 调 pH 至 8.0，定容至 500 mL，高压灭菌。 6.2.3 2×CTAB 提取液：分别称取 20 g CTAB 和 81.7 g NaCl，加水溶解，分别加入 40 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）、100 mL 1.0 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，加水定容至 1000 mL，高压灭菌。使用 时，按 2%（M/V）加入聚乙烯吡咯烷酮 K30（PVP-K30）。 6.2.4 2×KASP Master Mix：包括 Taq DNA 聚合酶、通用荧光引物、dNTP、镁离子、ROX 内参荧光染料。 6.2.5 KASP 引物：包括 10 µM Primer_Allele X、10 µM Primer_Allele Y、10 µM Primer_Allele C。 7 检测程序与方法 样品要求 供检样品与对照样品应符合下列要求： 2 DB15/T 2784—2022 ——供检样品和对照样品可以为幼叶或种子； ——供检样品与对照样品为种子时，样品的取样、分样应符合 GB/T 3543.2 的规定； ——供检样品与对照样品为种子时，样品的纯度应符合 GB 4407.2 的规定； ——供检样品允许采用混合样检测或单株检测。混合样制备应至少来源于 30 个个体，单株检测 应不少于 30 个个体。 DNA 提取 本文件推荐采用CTAB法提取DNA，其它能满足PCR扩增质量要求的提取方法均可适用。具体操作如下： a) 采集供检及对照样品的种子或幼嫩组织 200 mg～300 mg，置于 2.0 mL 离心管，放入 4 mm 钢 珠，用全自动样品快速研磨仪于 50 Hz 振动 50 s，重复 2～3 次，使叶片充分打碎； b) 加入 600 μL 于 65 ℃预热的 CTAB 提取液，65 ℃温浴 60 min，期间颠倒混匀多次； c) 加入等体积的三氯甲烷，颠倒混匀 3 min，于 12000 rpm 离心 10 min； d) 取上清液 450 mL 于新的 1.5 mL 离心管，加 0.6 倍体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，12000 rpm 离心 5 min，弃去上清液； e) 用 300 μL 70%乙醇溶液洗涤 2 遍，自然干燥后，加 200 μL ddH2O 充分溶解 DNA； f) 检测 DNA 浓度并稀释至 25 ng/μL～50 ng/μL，置于 4 ℃保存备用。 PCR 检测 7.3.1 总则 配制反应体系时，应同时设置1～2个无DNA模板的阴性对照（NTC）。根据NTC信号强弱，判断最适 扩增循环数。若NTC信号过高，与其它基因型掺杂，则应降低扩增循环数。 7.3.2 推荐标记 标记选择的基本原则是：遗传多态性高、基因组上分布均匀、基因型分型质量好、重复稳定性好等。 本文件采用的SNP推荐标记及KASP引物序列见附录A。 7.3.3 实时荧光定量 PCR 反应体系 本文件推荐以下PCR扩增反应体系（见表1），其中2×KASP Master Mix含有dNTP、Taq DNA聚合酶、 通用荧光引物及ROX荧光内参等。 其它兼容KASP的SNP检测体系均适用于本文件。依据PCR缓冲液类型、微孔板类型及检测平台，试验 条件可做相应调整。 表1 PCR 扩增反应体系 成份 原浓度 终浓度 推荐用量（μL） DNA 25 ng/μL～50 ng/μL 7.5 ng/μL～15 ng/μL 1.20 2×KASP Master Mix 2× 1× 2.00 Primer_Allele X 10 μM 0.15 μM 0.06 Primer_Allele Y 10 μM 0.15 μM 0.06 Primer_C 10 μM 0.40 μM 0.16 ddH2O - - 0.52 总体积 - - 4.00 7.3.4 实时荧光定量 PCR 反应程序 3 DB15/T 2784—2022 荧光定量PCR反应按照下列程序进行： a) 预变性：94 ℃预变性 15 min； b) 梯度 PCR：94 ℃变性 20 s，65 ℃（每循环降低 0.8 ℃），退火和延伸 60 s，10 个循环； c) 扩增：94 ℃变性 20 s，57 ℃退火和延伸 60 s，荧光信号读取，30 个循环。 注： 以上为推荐的基于实时荧光定量PCR仪检测平台的操作程序和参考条件，其他如Genomics SNPLine、Array Tape、 IntclliQube、微流控SNP芯片等利用KASP方法实现基因分型的检测平台同样适用于本文件。 8 数据采集和记录 采用实时荧光定量 PCR 仪提供的数据分析软件，对每个标记产生的 SNP 荧光信号和基因型分型值 进行分析。 按照分型明确、NTC(无样品阴性对照)无特异性扩增的原则，保留或剔除该标记位点的数据。若一 个样品的缺失标记位点数占比大于等于 5%，则不予采用，需重做。 数据记录为 X/Y，其中 X、Y 为同一位点上两个不同的等位变异，即纯合基因型记录为 XX 或 YY， 杂合基因型记录为 XY；缺失位点记录为-/-。 9 真实性验证 根据供检样品与对照样品在 96 个推荐标记中的差异位点数，进行品种真实性验证。 实际检测中，允许首先采用 48 个随机挑选的标记进行检测，若出现大于 5 个以上的异型个体，可 终止检测，进行结果判定。 具体鉴定意见参考以下规则： ——当差异位点数大于等于 5 个时，排除两者为同一品种； ——当差异位点数大于等于 1 且小于等于 4 个时，不确定两者为同一品种； ——当差异位数等于 0 个时，不排除两者属于同一品种。 注： 对于有异议的样品，可按GB/T 3543.5的规定进一步开展田间小区种植鉴定。 10 鉴定结果报告 品种真实性验证结果可参考下列方式进行填报： 利用 个SNP引物，采用 平台进行检测，与对照样品相比，供检样品中共 检测出差异位点数 个，差异位点的SNP标